Признания богатое: Компанию самого богатого экс-депутата Волгоградской облдумы могут признать несостоятельной

Лучшие менеджеры способствуют созданию атмосферы признания, в которой хвалят со всех сторон, и каждый знает, как другие любят получать признание. Этот тип обратной связи с сотрудниками должен быть частым — Gallup рекомендует каждые семь дней — и своевременным, чтобы гарантировать, что сотрудник знает значимость недавнего достижения, и укрепить ценности компании.

Критерии признания должны соответствовать цели, бренду и культуре компании и отражать ее стремление к индивидуальности, чтобы вдохновлять других. Поощрение сотрудников, не являющихся лучшими исполнителями, может отрицательно сказаться на мотивации высокоэффективных сотрудников. Таким образом, компании должны указать конкретные стандарты для наград, чтобы избежать негативной реакции.

Великие менеджеры знают, что никогда не смогут дать слишком много признания, если оно будет честным и заслуженным. Признание лучшей работы сотрудника имеет большое значение для того, чтобы заставить его или ее почувствовать себя ценным и может привести к другим желательным результатам на рабочем месте.

Новое исследование открывает секрет признания сотрудников

Мы только что завершили комплексный исследовательский проект по признанию сотрудников (говоря «спасибо»), и результаты действительно поразительны: организации, которые регулярно благодарят своих сотрудников, намного превосходят те, которые этого не делают.

Сегодня рынок признания сотрудников (золотые часы, значки, благодарственные награды, плакаты и т. Д.) Оценивается в 46 миллиардов долларов, и наши исследования показывают, что компании тратят 1-2% от фонда заработной платы на такие вещи. Это огромный рынок.

Тем не менее, когда мы посмотрели, куда идут эти деньги, мы обнаружили, что 87% программ признания сосредоточены на владении и владении. Да это правильно. Люди получают вознаграждение за , придерживаясь .

Наше исследование показало, что системы вознаграждения, основанные на сроках пребывания в должности, практически не влияют на деятельность организации .Вы проработали дополнительный год на последней работе, чтобы получить значок на 10 лет? Я в этом сомневаюсь.

Оказывается, что многие из этих программ поощрения за выслугу лет на самом деле являются программами, унаследованными от начала века, когда профсоюзы вынуждали руководство назначать сотрудникам «служебные награды» и почасовые повышения за время пребывания в должности. В большинстве крупных компаний эти программы существуют и сегодня, но только 58% сотрудников знают о существовании таких программ. Так что по большей части они не создают большой ценности.

С другой стороны, наше исследование показало, что современные переработанные программы распознавания могут иметь огромное влияние на эффективность бизнеса.Компании, которые попали в топ-20% за создание «культуры признания», на самом деле имели на 31% меньшую текучесть кадров! Это огромная статистика. Большинство генеральных директоров заплатили бы миллионы долларов за сокращение добровольной текучести (это когда хорошие люди уходят сами). Оказывается, такого результата можно добиться с помощью грамотно разработанной программы распознавания.

Позвольте мне перечислить 5 лучших лучших практик, которые мы обнаружили:

1. Узнавайте людей по определенным результатам и поведению.

Не давайте просто вознаграждение за то, что он «работник месяца». Дайте им награду за выдающееся обслуживание клиентов при возникновении конкретной проблемы. Это создает культуру «поступать правильно».

2. Реализуйте одноранговое распознавание, а не сверху вниз.

Признание лидеров оказывает меньшее влияние, чем вы думаете. Хотя менеджеры по персоналу считают, что это ключевой критерий успеха, сотрудники сказали нам, что они чувствуют себя намного лучше, когда их признают коллеги.Почему это? Коллеги знают, что вы делаете изо дня в день, поэтому, когда они «благодарят вас» за ваши усилия, влияние оказывается гораздо более значимым. Признание сверху вниз часто рассматривается как политическое, и оно редко достигает «тихих, но критичных высокопроизводительных сотрудников» в компании.

Современные высокопроизводительные программы признания являются «социальными» — они позволяют любому сотруднику компании узнавать кого-либо еще (часто используя «баллы» или «доллары»). Благодарности полностью публичны и отображаются в «таблице лидеров», чтобы любой мог увидеть их. Горячие стартапы, такие как Achievers и Globoforce, продают облачные платформы, которые упрощают эту задачу, и традиционные компании, предлагающие вознаграждение, такие как OC Tanner, также движутся в этом направлении.

3. Поделитесь историями признания.

Одним из наиболее эффективных методов, которые мы определили, было «рассказывание историй». Когда кто-то делает что-то великое и его признают коллеги, расскажите об этом людям. Они не только должны получить парковочное место «Сотрудник месяца» (шучу — они напоминают мне, кстати, фильм «Офисное пространство»), но вы должны упомянуть их в информационном бюллетене или блоге компании.Эти истории способствуют вовлечению и обучению сотрудников.

В нашем бизнесе мы проводим еженедельные конференц-звонки в масштабах всей компании, и мы стараемся каждую неделю отмечать кого-то за их вклад. Это не только улучшает самочувствие человека, но и позволяет нашей руководящей команде продвигать поведение и результаты, которых мы ожидаем от всех. Мы также используем одноранговую систему, которая создает свою собственную «раскадровку» производительности и благодарности.

4. Сделайте распознавание простым и частым.

Сделайте так, чтобы сотрудникам было легко узнавать друг друга. Многие из современных программ, которые мы изучили, дают всем сотрудникам бюджет в «баллах» или «долларах», и они могут передать их другим онлайн за секунды. Мы используем одну из этих систем в нашей компании, и результаты были потрясающими. Люди, которые делают великие дела, теперь видны всем!

5. Свяжите признание с ценностями или целями вашей компании.

Такие компании, как Deloitte и Intuit, имеют программы признания, ориентированные на миссию и цели компании.Поэтому, когда вы вручаете кому-либо награду «спасибо», она привязана к стратегии вашей компании (обслуживание клиентов, инновации, командная работа или даже цель сокращения доходов или затрат).

Я знаю, что это звучит пушисто и не по-деловому, но поверьте мне, это работает. Слишком многие генеральные директора и менеджеры сосредотачиваются на конечных результатах, не задумываясь о том, каково это усердно работать, не сказав ни слова благодарности.

Психология узнавания

В иерархии потребностей Маслоу две самые ценные психологические потребности, которые есть у нас, как у людей, — это потребность в том, чтобы их ценили, и потребность «принадлежать».«Эти потребности удовлетворяются посредством взаимной благодарности и признания. Взгляните на иерархию ниже: вы можете увидеть, что компенсация и льготы поддерживают основную потребность, но признание и продвижение по службе поддерживают наши психологические потребности более высокого уровня.

Рис. 1. Иерархия потребностей Маслоу (и где уместно признание)

Помните, что цель признания — повысить уровень «дискреционных усилий». Такие дискреционные усилия возникают, когда мы, как люди, чувствуем побуждение делать больше.

Гормоны играют свою роль

Одно последнее очко. Признание оказывает физиологическое влияние на производительность.

Окситоцин — хорошо известный «гормон любви». Наши тела вырабатывают окситоцин, когда мы чувствуем себя любимыми или ценными (даже если кому-то пожать руку или обнять его, этот гормон образуется). Недавние исследования показывают, что люди, которые работают под воздействием окситоцина, работают лучше и заслуживают большего доверия.

Когда ваша компания внедряет современную программу признания, и люди начинают благодарить друг друга, возрастает доверие и вовлеченность, улучшая моральный дух сотрудников, повышая качество и качество обслуживания клиентов.

Конечно, признание не отменяет необходимости обратной связи, отчетности и постановки целей. Эти программы управления производительностью по-прежнему крайне необходимы для обеспечения согласованности и производительности. Но наше исследование определенно показывает, что 83% исследованных нами организаций страдают от дефицита «узнаваемости». И эти компании отстают от конкурентов.

И еще кое-что. Признание — это не только то, что должны делать руководители — оно должно происходить во всей организации.Исследование ясно показывает, что нисходящее признание — это не то, что делает компании сегодня успешными, а признание ваших коллег, людей, с которыми вы работаете каждый день.

В следующий раз, когда вы увидите, что кто-то поступает правильно, найдите минутку и открыто поблагодарите его.

Это хороший менеджмент и хороший бизнес.

(Для получения дополнительной информации прочтите обзор рынка «Превращение благодарности в производительность».)

Новый механизм распознавания ДНК с высоким содержанием AT для бактериального ксеногенного глушителя MvaT

Abstract

Бактериальные ксеногенные белки сайленсинга избирательно связываются и подавляют экспрессию из многих областей хромосомы, богатых AT.Они служат главными регуляторами горизонтально приобретаемой ДНК, включая большое количество генов вирулентности. К настоящему времени идентифицированы три различных семейства ксеногенных сайленсеров: H-NS Proteobacteria, Lsr2 актиномицетов и MvaT Pseudomonas sp. Хотя белки семейств H-NS и Lsr2 структурно различаются, все они распознают малую бороздку AT-богатой ДНК через общий AT-крючкообразный мотив, который отсутствует в семействе MvaT. Таким образом, механизм связывания ДНК MvaT не определен.Здесь мы сообщаем характеристики последовательностей ДНК, на которые нацелен MvaT, с помощью микрочипов связывания белков, что указывает на то, что MvaT предпочитает связывание гибких последовательностей ДНК с несколькими этапами TpA. Мы демонстрируем явные различия в предпочтениях последовательностей между MvaT и двумя другими семействами ксеногенных глушителей. Мы также определили структуру ДНК-связывающего домена MvaT в комплексе с высокоаффинным додекамером ДНК, используя ЯМР в растворе. Это первая экспериментальная структура ксеногенного сайленсера в комплексе с ДНК, которая показывает, что MvaT распознает АТ-богатую ДНК как посредством считывания оснований мотивом «AT-pincer», вставленного в малую бороздку, так и посредством считывания формы несколькими лизиновыми сторонами. цепи, взаимодействующие с сахарно-фосфатным остовом ДНК.Мутации ключевых остатков MvaT для связывания ДНК подтверждают их важность с помощью анализов in vitro и in vivo . Этот новый способ связывания ДНК позволяет MvaT лучше переносить прерывания пар оснований GC в сайте связывания и меньше отдавать предпочтение ДНК тракта А по сравнению с H-NS и Lsr2. Сравнение MvaT с другими бактериальными ксеногенными глушителями дает ясную картину того, что природа разработала уникальные решения для разных родов бактерий, чтобы отличать чужеродную ДНК от собственной.

Сведения об авторе

В процессе эволюции бактерии часто приобретают новые гены посредством горизонтального переноса, чтобы адаптироваться к новой среде. Однако приобретенные чужеродные последовательности ДНК скорее уменьшат, чем увеличат приспособленность бактерий-реципиентов. Поэтому многие роды бактерий развили уникальные белки, которые избирательно подавляют транскрипцию чужеродных генов. Условно-патогенный микроорганизм Pseudomonas aeruginosa является основной причиной заболеваемости и смертности пациентов с муковисцидозом и одной из основных причин нозокомиальных инфекций. В качестве ксеногенного сайленсера белок MvaT P . aeruginosa является главным регулятором горизонтально приобретенных генов, в том числе многих критических для устойчивости к лекарствам и вирулентности. Здесь мы охарактеризовали последовательности ДНК, на которые преимущественно нацелен MvaT, и выявили различия в предпочтениях последовательностей между MvaT и другими ксеногенными сайленсерами. Структура высокого разрешения ДНК-связывающего домена MvaT в комплексе с высокоаффинной ДНК-мишенью выявляет новый механизм распознавания малых бороздок ДНК, богатых AT, который прекрасно объясняет характерные особенности предпочтений последовательности ДНК MvaT.Сравнение MvaT и других бактериальных ксеногенных сайленсеров демонстрирует, как различные бактериальные роды использовали уникальные решения для отличия чужеродной ДНК от ДНК их собственного генома.

Образец цитирования: Ding P, McFarland KA, Jin S, Tong G, Duan B, Yang A, et al. (2015) Новый механизм распознавания ДНК с высоким содержанием AT для бактериального ксеногенного глушителя MvaT. PLoS Pathog 11 (6): e1004967. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004967

Редактор: Чжао-Цин Луо, Университет Пердью, СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ

Поступила: 19 января 2015 г .; Принята к печати: 21 мая 2015 г .; Опубликован: 11 июня 2015 г.

Авторские права: © 2015 Ding et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника

Доступность данных: Все соответствующие данные либо в документе и файлах с вспомогательной информацией или в публичном хранилище. Координаты структур доступны в Protein Data Bank (инвентарные номера 2MXE и 2MXF).Назначения химического сдвига доступны в банке данных биомолекулярного магнитного резонанса (номера доступа 25405, 25407).

Финансирование: BX поддерживается грантом Национальной программы фундаментальных исследований Китая 973 Program (2012CB3) (www.most.gov.cn). WWN поддерживается операционным грантом Канадского института медицинских исследований (MOP-86683) (http://www.cihr-irsc.gc.ca/). SLD получил поддержку гранта AI105013 Национальных институтов здравоохранения (www.nih.gov). JL был поддержан грантом Национального фонда естественных наук Китая (31128005) (www.nsfc.gov.cn). TRH поддерживается грантом Канадского института медицинских исследований (MOP-111007) (http://www.cihr-irsc.gc.ca/). GT поддерживается стипендией Александра Грэхема Белла для выпускников Канады от Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (NSERC). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Введение

Горизонтальный перенос генов, или латеральный перенос генов, относится к приобретению организмом чужеродных генов не от прямого предка. Это основная эволюционная сила бактерий и одноклеточных эукариот [1], и недавнее исследование даже предполагает, что горизонтальный перенос генов также может вносить вклад в эволюцию животных [2]. Хотя бактерии часто приобретают чужеродные гены для адаптации к окружающей среде, экспрессия чужеродных генов в новом хозяине с большей вероятностью снижает приспособленность бактерий [3].Бактериальные ксеногенные белки сайленсинга избирательно связываются и репрессируют транскрипцию из областей ДНК, которые значительно более богаты AT, чем весь геном, которые, вероятно, будут получены посредством горизонтального переноса генов [4–6]. Подавляя экспрессию многих AT-богатых генов, эти сайленсеры повышают вероятность того, что вновь приобретенные последовательности будут переноситься организмом-реципиентом. Недавнее исследование также показывает, что одной из основных функций ксеногенных сайленсеров является подавление токсической инициации внутригенной транскрипции горизонтально приобретенной AT-богатой ДНК [7]. Молчание чужеродной ДНК может усилить эволюцию бактерий, позволяя пулу потенциально полезных генов тайно существовать в популяции. Такие гены иногда находят применение, когда отдельная клетка в популяции развивает необходимую регуляторную схему для контроля экспрессии гена в соответствующих условиях окружающей среды и времени [8–13]. В результате своей активности ксеногенные глушители являются главными регуляторами горизонтально приобретенных последовательностей, в том числе многих критических для лекарственной устойчивости и вирулентности, в большом количестве важных бактериальных патогенов, включая Mycobacteria , Vibrio , Salmonella , Escherichia , Yersinia , Bordetella и Pseudomonas [14–28].

Ксеногенные белки сайленсинга можно разделить на три отдельные группы на основе сходства последовательностей: H-NS-подобные белки, которые обнаруживаются во многих родах альфа, бета и гамма-протеобактерий, белки Lsr2, обнаруженные у актинобактерий, и MvaT -подобные белки псевдомонад [5]. Все они имеют одинаковую структуру доменов с N-концевым доменом олигомеризации и C-концевым доменом связывания ДНК [29, 30]. Эти белки могут кооперативно связываться с большими участками ДНК, и недавние исследования показывают, что образование нуклеопротеиновых филаментов важно для их функции подавления гена [31–34].ДНК-связывающие домены Lsr2 из Mycobacterium tuberculosis и H-NS из Escherichia coli и Salmonella typhimurium были решены, и их взаимодействия с ДНК были смоделированы с использованием данных титрования из исследований ЯМР [16, 29, 35– 37]. Интересно, что Lsr2 и H-NS, несмотря на то, что они структурно различны, используют общий механизм для избирательного нацеливания на AT-богатую ДНК путем встраивания AT-крючковидного мотива «Q / RGR» в малую бороздку ДНК. Другой белок семейства H-NS, Ler, в котором мотив, напоминающий крючок AT, заменен последовательностью «VGR», только вставляет боковую цепь аргинина в малую бороздку ДНК и может облегчить опосредованное H-NS молчание оперонов вирулентности в энтеропатогенном Е . coli [38].

MvaT был первоначально идентифицирован как глобальный регулятор экспрессии гена вирулентности в Pseudomonas aeruginosa , а впоследствии было показано, что он является репрессором фимбриального кластера cupA , необходимого для образования биопленок [23, 39, 40]. MvaT был охарактеризован как функциональный аналог H-NS из-за его способности дополнять различные фенотипы E . coli Δhns мутант [41]. Анализ транскриптома и иммунопреципитации хроматина в сочетании с ДНК-микрочипами (ChIP-on-chip) показал, что MvaT и его паралог MvaU предпочтительно связывают AT-богатые области P . aeruginosa , чтобы регулировать ~ 350 генов и что существует почти полное перекрытие в наборах генов, находящихся под контролем каждого белка, хотя почему существуют очевидно повторяющиеся паралоги, неясно [22, 42]. Помимо оперона cupA , много генов вирулентности от P . aeruginosa репрессируются MvaT / MvaU, например, гены, необходимые для синтеза окислительно-восстановительного пигмента и токсина пиоцианина, а также гены, относящиеся к системам секреции типа III и типа VI [22]. Потеря как MvaT, так и MvaU смертельна для P . aeruginosa штамм PAO1, феномен, который связывают с тем фактом, что эти белки ингибируют активацию профага Pf4 [43]. Структурные предсказания предполагают, что MvaT / MvaU, вероятно, произошел от семейства H-NS, однако оба белка имеют очень низкую идентичность последовательностей с H-NS и не имеют канонического мотива H-NS, который содержит структуру, подобную AT-крючку [5, 41] . Это оставляет открытым вопрос о том, как MvaT-подобные белки нацелены на ДНК, богатую AT.

В этой работе мы провели структурный и функциональный анализ ДНК-связывающих свойств MvaT. Высокопроизводительные анализы связывания ДНК показывают, что MvaT предпочитает очень гибкие последовательности, которые содержат несколько этапов TpA, и имеет значительную устойчивость к прерываниям пар оснований GC в сайтах связывания. Мы решили структуру раствора ДНК-связывающего домена MvaT в его свободной форме и в комплексе с высокоаффинным додекамером ДНК и обнаружили, что, как H-NS и Lsr2, MvaT распознает структурные особенности в малой бороздке, уникальные для AT-богатых ДНК. С мотивом «AT-pincer», вставленным в малую бороздку, и несколькими остатками лизина, взаимодействующими с сахарно-фосфатным остовом ДНК, двойная спираль была искажена значительным открытием малой бороздки, напоминающей несколько других белков, нацеленных на гибкие последовательности, богатые TpA. . Роль остатков, считающихся критическими для связывания, была оценена как in vitro, и in vivo, , которые показали, что, хотя одиночные замены аминокислот не полностью отменяют активность связывания ДНК из-за обширных контактов между MvaT и ДНК, эти замены с значительно сниженная активность связывания ДНК делает белок нефункциональным in vivo .Наконец, наши структурные данные показывают, что MvaT-подобные белки, вероятно, произошли от паралога H-NS, но приобрели способ связывания, который значительно отличается от других ксеногенных сайленсеров.

Результаты

MvaT связывается со своей целевой ДНК с медленной скоростью

Предыдущий анализ ChIP-on-chip показал, что MvaT преимущественно связывается с AT-богатыми участками хромосомы [22]. Анализы сдвига электрофоретической подвижности (EMSA) проводили с очищенным полноразмерным MvaT против меченного радиоактивным изотопом фрагмента промотора cupA1 размером 340 п.н. (% GC = 54), который, как ранее было показано, связывает MvaT in vivo, и in vitro, .В качестве отрицательного контроля мы использовали фрагмент 204 п.н. P . aeruginosa Ген PAO1 PA3900 (% GC = 74), который находится в пределах GC-богатой области генома размером ~ 180 т.п.н., не содержащей никаких сайтов связывания MvaT in vivo . MvaT был способен сдвигать оба меченых фрагмента ДНК при инкубации с любым фрагментом отдельно, с очевидными константами диссоциации 57 ± 22 нМ и 154 ± 53 нМ в сторону промотора cupA1 и PA3900 фрагментов, соответственно.Аффинность связывания MvaT с GC-богатым фрагментом PA3900 очень близка к таковой (~ 148 нМ), определенной ранее с помощью EMSA [32].

Хотя сродство MvaT к ДНК промотора cupA1 всего в ~ 3 раза выше, чем у фрагмента PA3900 , при использовании конкурентных анализов наблюдались значительные различия (рис. 1). MvaT, предварительно инкубированный с радиоактивно меченным GC-богатым фрагментом PA3900 , был замещен немеченой промоторной ДНК cupA1 при менее чем 5-кратном молярном избытке.Напротив, 200-кратный избыток немеченой ДНК PA3900 не смог вытеснить MvaT из предварительно сформированного комплекса с радиоактивно меченным фрагментом cupA1 . Эти данные указывают на то, что олигомеры MvaT, вероятно, взаимодействуют с GC-богатой ДНК посредством серии сопряженных низкоаффинных взаимодействий. Субъединицы в олигомерах MvaT часто диссоциируют от GC-богатой мишени, что позволяет быстро удалить белковый олигомер из ДНК. На фрагменте промотора cupA1 , который является сравнительно AT-богатым, белок MvaT образует олигомерный комплекс, достаточно стабильный, и для его замещения требуется 25-кратный избыток немеченой ДНК cupA1 .Это указывает на то, что после связывания с соответствующим целевым фрагментом олигомеры MvaT образуют высокостабильные комплексы, которые диссоциируют с очень медленными скоростями. Эти результаты согласуются с открытием, что MvaT может кооперативно связываться с большими участками ДНК и формировать нуклеопротеиновые филаменты [32]. В таких нуклеопротеиновых филаментах диссоциация MvaT в основном происходит на двух концах, где затраты энергии ниже, чем внутри филамента, что приводит к замедлению скорости связывания.

Рис 1.Анализ конкурентного связывания ДНК для связывания MvaT с ДНК промотора cupA1 и фрагментом PA3900 .

Комплексы MvaT (300 нМ) с 1 нМ радиоактивно меченным фрагментом ДНК промотора АТ cupA1 (верхняя панель) или радиоактивно меченным GC-богатым фрагментом ДНК PA3900 (нижняя панель) были предварительно сформированы перед добавлением избытка немеченой ДНК конкурента, как указано.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004967.g001

MvaT демонстрирует тонкие, но явные отличия в предпочтениях последовательностей ДНК от H-NS и Lsr2

Специфичность связывания ДНК MvaT дополнительно исследовали с использованием микрочипов связывания белков (PBM). Меченый GST MvaT применяли к микрочипам, содержащим 41944 двухцепочечных 60-мерных олигонуклеотидных целевых последовательностей, каждая из которых содержит константную 25-членную последовательность праймера, за которой следует вариабельная 35-членная последовательность. Два разных массива (обозначенных ME и HK) были разработаны таким образом, что все возможные непалиндромные 8-мерные представлены 32 раза (16 раз для палиндромных 8-мерных) на каждом массиве [44, 45]. Объединенные данные (среднее значение) из двух независимых экспериментов с массивами были использованы для анализа относительных предпочтений связывания, обеспечивая беспристрастную оценку относительного предпочтения каждого 8-мера, которая устойчива к вариациям положения, местоположения и фланкирующей последовательности [29, 44] .

Относительное предпочтение связывания MvaT для каждой 8-мерной последовательности рассчитывали с использованием основанной на рангах непараметрической статистической меры ( E -балл), которая в значительной степени инвариантна к концентрациям белка. Это облегчает сравнение разных экспериментов в одном масштабе, что полезно при оценке различий в мишенях связывания между разными белками, такими как MvaT и H-NS [44, 46]. Оценка E варьируется от 0,5 (самый высокий) до -0,5 (самый низкий). Случайные перестановки данных массива указывают на то, что не должно быть случайной 8-мерной последовательности, которая достигает значения E выше 0.45 [47]. Эксперименты с PBM идентифицировали множественные 8-меры с оценкой E выше 0,45 для MvaT, а наивысшая оценка была около 0,49, что указывает на то, что некоторые последовательности были явно предпочтительными мишенями для связывания MvaT, чем другие (S1 Dataset).

Как показано на рис. 2, целевые предпочтения MvaT сравнивались с теми, которые ранее были определены в аналогичных экспериментах для H-NS и Lsr2 [29]. В соответствии с более ранними исследованиями последовательности, наиболее тесно связанные со всеми тремя белками, были в подавляющем большинстве случаев AT-богатыми, поскольку оценка PBM E MvaT также положительно коррелирует с содержанием AT в 8-мерах (рис. 2A).Это обеспечивает основу для их функционального сходства и того, что MvaT может дополнять различные фенотипы E . coli Δhns мутант [41].

Рис. 2. Микроматричный анализ связывания белков предпочтений связывания ДНК для MvaT, H-NS и Lsr2.

PBM для H-NS и Lsr2 были опубликованы ранее [29]. Коробчатые диаграммы Тьюки показывают распределение баллов E 8-мерных олигонуклеотидных последовательностей, а усы указывают точки в пределах 1,5 межквартильного диапазона.На всех диаграммах параметры последовательности нанесены на график по шкале E , которая отражает относительное сродство к конкретной последовательности. (A) E -оценка по сравнению с содержанием AT 8-мерной целевой последовательности. (B) Количество стадий TpA для олигонуклеотидов, содержащих только A или T (100% AT). (C) Длина последовательности (последовательностей) A-тракта в 8-мерах с% GC ≥ 75. Некоторые последовательности содержат два A-тракта (например, AAAGGAAA), и в этих случаях указывается длина каждого. (D) E -оценка по сравнению с максимальной длиной непрерывных оснований A или T в последовательности 75% AT.Последовательности, такие как GCAATAAT, имеют 6 соседних оснований A или T, в то время как самый длинный участок соседних оснований A или T в 8-мерном AAGTTCAA составляет 2.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004967.g002

Однако более подробное сравнение предпочтений связывания между MvaT, H-NS и Lsr2 показывает, что существуют тонкие, но важные различия в способах связывания. И H-NS, и MvaT смещены в сторону последовательностей, содержащих несколько динуклеотидных стадий TpA (также называемых стадиями TpA), тогда как стадии TpA не влияют на связывание Lsr2 (рис. 2B).Действительно, последовательности с наивысшим сродством как к H-NS, так и к MvaT были составлены из нескольких смежных ступеней TpA, и одним из 8-меров с наивысшим баллом для каждой был TATATATA. Однако отсутствие шагов TpA в данной последовательности приводит к более высокому штрафу за связывание MvaT, чем за H-NS или Lsr2.

Больше, чем любая другая динуклеотидная стадия, включая стадии, содержащие G или C, TpA придает ДНК наибольшую гибкость [48]. Напротив, A-тракты (последовательности, состоящие из нескольких последовательных оснований A или T без TpA-шага) являются наиболее жесткими и негибкими из всех последовательностей ДНК [49].Наложение базового слоя в последовательностях А-тракта также сжимает малую бороздку больше, чем любой другой тип последовательности. В то время как присутствие A-трактов в последовательности в целом улучшало связывание как H-NS, так и Lsr2, A-тракты накладывали значительный штраф на связывание MvaT (фиг. 2C).

Также оценивалось влияние оснований G или C в целевом сайте на связывание с различными белками (рис. 2D). Примечательно, что все белки имели более низкое сродство к последовательностям, богатым АТ, когда один нуклеотид G или C был помещен в центр, но влияние на связывание MvaT было наименьшим.Оценивали связывание белков с 8-мерными последовательностями, содержащими шесть оснований A или T и два основания G или C в различных положениях. 8-мерные последовательности с двумя основаниями G или C могут иметь от 6 соседних нуклеотидов A или T (например, AATATAGG) до всего двух (например, AAGTTGAA). Эти данные показывают, что штраф как для H-NS, так и для Lsr2 увеличивается по мере уменьшения числа смежных нуклеотидов A или T. MvaT, с другой стороны, оказался более толерантным к прерыванию нуклеотидами G или C в пределах участка связывания, богатого AT, и многие 8-мерные последовательности с высокими показателями содержали только наборы из двух соседних нуклеотидов T или A.Эти различия в предпочтениях последовательностей подразумевают, что механизм распознавания ДНК MvaT может отличаться от механизма распознавания ДНК H-NS и Lsr2.

В последнее время были достигнуты значительные успехи в вычислительном прогнозировании конкретных параметров структуры ДНК. Структуры MvaT-связанных последовательностей, предсказанные с помощью DNAshape [50], показывают, что 20 лучших последовательностей с 100% AT 8-мерными оценками заметно отличаются по структуре от 20 100% AT 8-меров с самым низким показателем (S1 Рис. ). Последовательности с высоким уровнем связывания MvaT E — все содержат значительные участки, где малая бороздка превышает 5.5 Å в ширину, в то время как последовательности, получившие наименьшее количество баллов, по прогнозам, содержат гораздо более узкие малые бороздки, обычно менее 4 Å. Последовательности с наивысшей оценкой также имели более высокие значения для крена и кручения гребного винта и более низкие значения для винтовой кручения, чем последовательности с более низкой оценкой.

C-концевой домен MvaT связывает AT-богатую ДНК в малой бороздке

Мы определили структуру раствора С-концевого ДНК-связывающего домена MvaT (MvaT _ctd , остатки 77–124) из P . aeruginosa штамм PAO1 с использованием ядерного магнитного резонанса (ЯМР) с почти полным резонансным назначением (S2 фиг.). Ограничения и структурная статистика приведены в Таблице 1. MvaT _ctd состоит из трехцепочечного антипараллельного β-листа (β1, остатки 83–86; β2, остатки 93–96; β3, остатки 120–122) и двух α -спирали (α1, остатки 102–111; α2, остатки 113–119). MvaT _ctd принимает топологию β1-β2-α1-α2-β3, а петля (loop2, остатки 97–101) связывает шпильку β1-β2 и спирали α1-α2.N- и C-концевые области очень гибкие (рис. 3A). Две последовательные спирали упакованы на одной стороне трехцепочечного β-листа и образуют гидрофобное ядро, состоящее из остатков Tyr85, Ile94, Thr96, Thr103, Leu104, Trp107, Trp111, Val116, Trp119 и Ala120 (рис. 3B). Общий состав складок и вторичной структуры MvaT _ctd аналогичен таковым из C-концевого домена H-NS (H-NS _ctd ), за исключением того, что H-NS _ctd не имеет третьей цепи β3. и это спираль 3 ₁₀ вместо спирали α2 в MvaT _ctd [29].

Рис. 3. Структура раствора MvaT _ctd и его взаимодействие с AT-богатой ДНК.

(A) Наложение магистральных трасс для ансамбля из 20 структур MvaT _ctd . (B) Ленточное представление средней структуры MvaT _ctd . Боковые цепи остатков, образующих гидрофобное ядро, показаны оранжевым цветом. (C) Наложение 2D ¹ H- ¹⁵ N HSQC-спектров свободного (синий) и ДНК-связанного MvaT _ctd (красный, соотношение концентраций 1: 1).Указаны остатки, показывающие значительные изменения химического сдвига. (D) Комбинированные разности химического сдвига ¹ H и ¹⁵ N (Δδ _{гребенка} = [δ _HN ² + (δ _N / 6,5) ² ] ^1/2 ) между свободный и связанный с ДНК-MavT _ctd нанесены на график в зависимости от номера остатка (синие столбцы). (E) Наложение области отпечатка пальца, показывающее пики NOE h2’-H6 / H8 внутри остатка спектров 2D ¹ H NOESY свободной (синий) и MvaT _ctd -связанной ДНК (красный; соотношение концентраций 1: 1).Последовательность и вторичная структура додекамера ДНК показаны выше, а остатки, на которые влияет связывание MvaT _ctd , показаны зеленым цветом. (F) ¹ H разности химических сдвигов (Δδ) для h2 ’(синие столбцы) и H6 / H8 (желтые столбцы) между свободной ДНК и ДНК, связанной с MvaT _ctd , нанесены на график в зависимости от количества остатков.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004967.g003

Поверхности взаимодействия MvaT _ctd и ДНК картировали с помощью экспериментов по титрованию ЯМР.Дуплекс ДНК d (CGCATATATGCG) ₂ , который мы называем «3AT», был выбран, поскольку он содержит последовательность среди тех, которые получили самые высокие баллы в нашем исследовании PBM. Сравнение 2D ¹ H- ¹⁵ N HSQC-спектров MvaT _ctd в свободной и ДНК-связанной форме показывает, что остатки со значительными комбинированными различиями химического сдвига NH (Δδ _{гребешок} > 0,25 м.д.) представляют собой Arg80, Lys81 , Tyr85 и Lys97-Lys105 (фиг. 3C и 3D), в основном расположены в N-концевой области, loop2 и начале спирали α1.Эти остатки, за исключением Tyr85, сгруппированы в структуре MvaT _ctd , составляя сайт связывания ДНК. На Tyr85, вероятно, воздействуют косвенно через его ароматическую боковую цепь, которая выходит прямо к петле 2. Стехиометрия связывания представляет собой одну молекулу MvaT _ctd с одной молекулой дуплекса 3AT, что оценивается путем подбора изменений химического сдвига с различными концентрациями ДНК, что также было подтверждено результатами калориметрии изотермического титрования (ITC, см. Ниже).Сравнивая 2D ¹ H NOESY спектры ДНК, свободной или в комплексе с белком, мы также картировали области 3AT, которые взаимодействуют с MvaT _ctd . Значительные внутриостаточные сдвиги пиков h2’-H6 / H8 NOE (h2 ’или H6 / H8 Δδ> 0,025 м.д.) происходят в центральных остатках ATATATG (рис. 3E и 3F).

Чтобы подтвердить, что MvaT _ctd связывает малую бороздку, мы провели конкурентный эксперимент с использованием нетропсина, природного олигопептида, который связывает малую бороздку АТ-богатой ДНК.При добавлении возрастающей концентрации нетропсина в образец ¹⁵ N-MvaT _ctd , содержащий двукратный избыток 3AT, сигналы ЯМР MvaT _ctd сместились из связанной с ДНК формы обратно в свободную форму. постепенно, что указывает на то, что комплекс MvaT _ctd / ДНК был разрушен нетропсином в зависимости от концентрации. При соотношении нетропсин / ДНК 2,5: 1 спектр HSQC 2D ¹ H- ¹⁵ N почти идентичен спектру свободного MvaT _ctd , что указывает на то, что нетропсин почти полностью высвобождает MvaT _ctd из 3AT.

Структура комплекса MvaT

В отличие от Lsr2 и H-NS [16, 29], ДНК-связанный MvaT _ctd имеет единственный набор сигналов NH, и ни один из сигналов NH не исчезает при связывании ДНК (S2 рис.), Что позволяет нам определить решение структура MvaT _ctd в комплексе с додекамером 3AT (рис. 4A). Структура комплекса MvaT _ctd / 3AT была определена с использованием 3541 экспериментальных ограничений расстояния, включая 57 ограничений межмолекулярного расстояния, и среднеквадратичное отклонение тяжелого атома основной цепи 20 конечных структур с самыми низкими энергиями AMBER равно 0. 49 Å (таблица 1).

Рис. 4. Структура MvaT _ctd и АТ-богатого комплекса ДНК.

(A) Наложение ансамбля из 20 структур комплекса MvaT _ctd / ДНК. Белковый каркас представлен лентой, а целевая ДНК показана линиями. (B) Электростатический потенциал MvaT _ctd , рассчитанный с помощью APBS в отсутствие ДНК. (C) Закройте окно привязки интерфейса. Остатки MvaT _ctd , участвующие в распознавании ДНК, показаны в виде полосок с однобуквенным кодом аминокислоты и обозначенными номерами остатков.(D) Схематическое изображение межмолекулярных контактов. ДНК изображена в виде цилиндрической проекции, если смотреть со стороны малой бороздки. Водородные связи между MvaT _ctd и основаниями ДНК указаны красными стрелками. Зеленые линии показывают гидрофобные контакты. Взаимодействия между положительно заряженными остатками лизина и фосфатными группами основной цепи ДНК показаны синими стрелками.

https://doi.org/10. 1371/journal.ppat.1004967.g004

Структура ДНК-связанного MvaT _ctd почти такая же, как у свободного MvaT _ctd , поскольку RMSD их основного тяжелого атома между среднее значение структур всего 0.90 Å. Основное различие состоит в том, что N-концевой участок становится более жестким, что согласуется с постепенным появлением сигнала ε-NH боковой цепи Arg80 при связывании с 3AT (S2B фиг.). Поверхность взаимодействия MvaT _ctd положительно заряжена (рис. 4B) и имеет площадь поверхности 1,707 ± 14 Å ² . Петля 2 MvaT _ctd частично вставлена ​​в малую бороздку ДНК, при этом остов остатков Gly99 и Asn100 контактирует с парами оснований AT внизу, в то время как остатки Lys97 и Gly98 наклонены к вершине малой бороздки.Амиды основной цепи Gly99 и Asn100 образуют водородные связи с атомом O2 T19 и атомом N3 A18 соответственно. Боковая цепь Asn100 простирается вдоль малой бороздки, а его группа δ-NH ₂ образует водородные связи с атомами O2 T9 и T17 (рис. 4C и 4D). Кроме того, боковая цепь Arg80 также вставляется в малую бороздку ДНК с ее гуанидиновой водородной группой, связанной с атомами O2 T5 и T21 (рис. 4C и 4D), и, таким образом, стабилизирует N-концевую область MvaT _ctd .Боковые цепи Arg80 и Asn100 направлены друг от друга и занимают область, покрывающую все шесть пар оснований AT вместе с петлей 2. Таким образом, этому ДНК-связывающему мотиву было дано название «AT-pincer», поскольку интеркалирующие малые бороздки остатки происходят из двух разных петель MvaT _ctd . Помимо взаимодействия с малой бороздкой ДНК, MvaT _ctd также содержит шесть остатков лизина (Lys81, Lys83, Lys97, Lys102, Lys105 и Lys108), которые хорошо расположены для гидрофобных или электростатических контактов с сахарно-фосфатным остовом ДНК через боковые стороны. цепи метиленовых групп или ε-аминогрупп, соответственно (рис. 4C и 4D).Боковая цепь Lys81 стабилизируется при связывании 3AT, в то время как боковые цепи Lys83, Lys97, Lys102, Lys105 и Lys108 уже четко определены в структуре свободного MvaT _ctd , поскольку эти боковые цепи лизина стабилизируются гидрофобными взаимодействиями с близлежащие остатки. Эта обширная сеть остатков лизина значительно увеличивает поверхность контакта с ДНК и является отличительной чертой MvaT _ctd . Этот способ связывания AT-богатой ДНК явно отличается от режима связывания H-NS и Lsr2, которые разделяют общий механизм связывания ДНК через AT-крючковидный мотив (подробное сравнение в разделе «Обсуждение»).

При связывании MvaT _ctd , малая канавка 3AT расширяется, а геометрия штабелирования основания значительно изменена. MvaT _ctd -связанный 3AT показывает увеличенные углы поворота и наклона по сравнению со свободной ДНК-декамером d (GGATATATCC) ₂ с той же центральной последовательностью ATATAT (PDB 2LWG [51]), ~ 9,6 ° и ~ 15,5 ° на шаг в среднее значение соответственно (рис. 5A), что указывает на то, что пары оснований локально изгибаются в направлении большой бороздки и, таким образом, открывают малую бороздку [49].Ширина малой бороздки 3AT, связанного с MvaT _ctd , достигает минимума на средней ступеньке основания A ₆ pT ₇ и постепенно расширяется к каждому концу последовательности ATATAT. Боковые цепи Arg80 и Asn100 расположены на базовых ступенях A ₄ pT ₅ и A ₈ pT ₉ соответственно, где ширина малых канавок значительно увеличена по сравнению с шириной канавок в структуре 2LWG. Вышеупомянутые боковые цепи лизина хорошо подходят к основной цепи 3AT в комплексе MvaT _ctd / ДНК, в то время как их конформации остаются аналогичными конформации в свободном белке.Таким образом, вероятно, что искажение дуплекса ДНК должно приспособиться к конформации этой «лизиновой сети». Напротив, ДНК A-тракта, как сообщается, обладает очень узкой малой бороздкой, а углы поворота и наклона последовательно малы или отрицательны [49, 52]. ДНК A-тракта также обнаруживает общий изгиб на ~ 15 ° в сторону малой бороздки [53], тогда как свободный и связанный с MvaT _ctd 3AT почти прямой (Рис. 5B). Это может объяснить, почему MvaT не отдает предпочтение ДНК A-тракта, поскольку жесткая ДНК A-тракта не имеет благоприятной конформации для связывания MvaT.

Рис. 5. Анализ конформации ДНК, связанной с MvaT _ctd .

(A) Выбранные параметры спирали структур раствора MvaT _ctd -связанной ДНК 3AT (синий), свободной ДНК с последовательностью ATATAT (PDB 2LWG) (пурпурный) и ДНК A-тракта с последовательностью AAAAAA (PDB 1FZX [52]) (золото). Показаны средняя ширина малой канавки, углы валка и наклона, включая стандартные отклонения. Указаны базовые ступени 3AT. (B) Средние структуры MvaT _ctd -связанных 3AT (синий), 2LWG (пурпурный) и 1FZX (золотой).Топоры показаны палками.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004967.g005

И «AT-клещи», и «лизиновая сеть» важны для связывания ДНК

Для изучения важности остатков, вовлеченных в структуру комплекса MvaT _ctd / ДНК, мы создали серию мутантов MvaT _ctd , содержащих замены R80A, K81A, K83A, K97A, N100A, K102A, K105A и K108A. Все эти мутации, за исключением K83A, не оказывают значительного влияния на общую структуру MvaT _ctd , поскольку спектры 2D ¹ H- ¹⁵ N HSQC этих мутантов аналогичны спектрам MvaT _{дикого типа (WT). ctd} (S3 Рис).Поскольку сигналы NH для K83A полностью отличаются от сигналов WT MvaT _ctd , мутация K83A, вероятно, привела к общему кратному изменению. Это указывает на то, что боковая цепь Lys83 играет важную роль в стабилизации структуры, поскольку она образует солевой мостик с Glu117, а его алифатические группы образуют гидрофобный контакт с Tyr85, Ala120 и Leu122.

Каждый мутант, за исключением K83A, затем титровали додекамером 3AT и оценивали с помощью ЯМР (S4 фиг.). Для мутантов K81A и K97A характер сдвига сигналов NH во время титрования ДНК весьма схож с таковыми для WT MvaT _ctd с точки зрения масштаба и направления, что позволяет предположить, что две мутации не должны оказывать значительного влияния на связывание ДНК MvaT _{. ctd} .Мутанты R80A, K102A демонстрируют пониженные изменения химического сдвига, но с аналогичными направлениями сдвига сигналов NH, что и у WT MvaT _ctd . Мутации N100A, K105A и K108A оказывают наиболее сильное влияние на паттерны возмущения сигнала NH, вызванные 3AT, с гораздо меньшими изменениями химического сдвига NH, а некоторые направления сдвига сигналов NH сильно отличаются от таковых у WT MvaT _ctd , что указывает на то, что эти мутации могут значительно нарушают режим связывания ДНК MvaT _ctd .

ITC для характеристики аффинности связывания между ДНК и MvaT _ctd или его мутантами (фиг. 6A и S5). Как и ожидалось, WT MvaT _ctd проявляет наивысшее сродство к 3AT, с K _d около 10,7 мкМ. Аффинность связывания для мутантов R80A и K108A более чем в 10 раз слабее, чем WT MvaT _ctd , тогда как значения K _d мутантов N100A и K105A увеличиваются более чем в 3 раза.Напротив, мутации K81A, K97A и K102A только приводят к немного более низкому сродству связывания ДНК ( K _d увеличивается на ~ 70%).

Рис. 6. Характеристика мутантов MvaT.

(A) Константы диссоциации для WT MvaT _ctd и его мутантов при связывании с 3AT, измеренные с помощью ITC. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение. (B) Фенотипы штаммов cupA lacZ , содержащих плазмиды, управляющие экспрессией WT MvaT или его мутантов (верхняя панель). Фазово-изменяющаяся экспрессия генов cupA может быть репрессирована путем предоставления гена mvaT в транс, что приводит к образованию белых колоний. Производная с функционально нарушенным MvaT дает рост колоний синего (фаза ВКЛ) и белого цвета (фаза ВЫКЛ). Вестерн-блоттинг с антителом против метки VSV-G (нижняя панель). Контроль загрузки образца вестерн-блоттинга исследуют антителом против α-субъединицы РНК-полимеразы. (C) Количественная оценка экспрессии cupA lacZ в культурах штаммов, содержащих WT MvaT или его мутанты.Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение среднего (n = 3).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004967.g006

MvaT _ctd связывается с GC-богатой ДНК, d (CGCGCGCG) ₂ дуплекс, с гораздо более слабым сродством ( K _d ~ 360 мкМ) (S5I Рис.). Примечательно, что WT MvaT _ctd и его мутанты связываются с АТ-богатой ДНК эндотермическим образом, указывая на то, что связывание является процессом, управляемым энтропией. Было высказано предположение, что большое положительное изменение энтальпии связано с десольватацией малой бороздки ДНК и искажением дуплекса ДНК, как мы наблюдали в комплексе MvaT _ctd / ДНК [54].Благоприятное изменение энтропии можно объяснить смещением высокоупорядоченных молекул воды в малой бороздке ДНК [55]. Напротив, связывание MvaT _ctd с GC-богатой ДНК управляется как энтальпией, так и энтропией, что позволяет предположить, что MvaT связывает GC-богатую ДНК совершенно другим способом.

Мутанты MvaT со значительно пониженной аффинностью связывания ДНК функционально нарушены

Затем мы проверили, важны ли те остатки MvaT, которые участвуют в связывании ДНК, для функции MvaT в клетках P . aeruginosa . Ранее было показано, что MvaT в P . aeruginosa репрессирует изменяющуюся по фазе экспрессию фимбриальных генов cupA [23]. В штамме PAO1 ΔmvaT cupA1 lacZ , где ген lacZ расположен ниже хромосомного гена cupA1 , гены cupA экспрессируются изменчивым по фазе образом, что проявляется появлением синих и белых колоний. на чашках с агаром LB, которые содержат хромогенный субстрат 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид (X-Gal).Это обратимое включение-выключение экспрессии гена cupA , наблюдаемое в клетках мутантного штамма ΔmvaT , может быть репрессировано путем предоставления гена mvaT в транс, приводящего к образованию белых колоний на чашках с агаром LB, содержащим X-Gal [23 ].

Чтобы проверить, могут ли мутанты MvaT, содержащие замены R80A, K81A, K83A, K97A, N100A, K102A, K105A и K108A, репрессировать фазово-переменную экспрессию фимбриальных генов cupA так же эффективно, как MvaT WT, мы ввели в клетки репортера плазмиды штамма PAO1 ΔmvaT cupA lacZ , управляющие синтезом либо WT MvaT, либо мутанта MvaT, каждая из которых содержит эпитопную метку гликопротеина вируса везикулярного стоматита (VSV-G) на своем С-конце.Затем клетки выращивали на чашках с агаром LB, содержащем X-Gal. Вестерн-блоттинг с использованием антитела против метки эпитопа VSV-G показал, что все белки были произведены в сопоставимых количествах, за исключением K105A, который был немного менее обильным, чем другие (рис. 6B).

В отличие от WT MvaT, содержащего метку эпитопа VSV-G (MvaT-V), мутанты MvaT-V R80A, K83A, N100A, K105A и K108A не смогли репрессировать фазово-переменную экспрессию репортера cupA lacZ (рис. 6B). Напротив, мутанты MvaT-V K81A, K97A и K102A могли репрессировать активность cupA , аналогично WT MvaT-V.Для дальнейшего выяснения влияния вариантов MvaT-V на репрессию cupA , экспрессию lacZ количественно определяли в клетках, выращенных в жидкой культуре, с помощью анализа β-галактозидазы. Это подтвердило, что варианты MvaT-V K81A, K97A и K102A могут репрессировать активность cupA так же, как и WT MvaT-V (фиг. 6C). Из мутантов MvaT-V, которые не смогли репрессировать cupA , вариант R80A был наиболее сходен с контролем с пустым вектором и, следовательно, наиболее дефектен, тогда как мутант K105A был наименее дефектным.Поскольку замена K105A, по-видимому, снижает количество MvaT-V, возможно, что сниженная способность мутанта K105A подавлять фазово-изменяющуюся экспрессию генов cupA может частично объясняться эффектами этой замены на изобилие белка. . Нарушение функции варианта K83A, вероятно, является результатом изменения укладки белка, как обсуждалось выше. У обоих мутантов N100A и K108A была значительно нарушена их способность подавлять экспрессию cupA в одинаковой степени (фиг. 6C).Эти находки демонстрируют, что мутанты MvaT, которые проявляют заметно сниженную аффинность связывания ДНК in vitro , следовательно, имеют функциональное нарушение in vivo .

Обсуждение

В этом исследовании мы выполнили всесторонний анализ свойств связывания ДНК и механизма ксеногенного глушителя MvaT от условно-патогенного микроорганизма P . aeruginosa . Мы продемонстрировали, что MvaT имеет более высокое сродство связывания с богатой АТ геномной ДНК-мишенью по сравнению с нецелевой ДНК, богатой GC.Кроме того, MvaT связывает свою целевую ДНК с гораздо меньшей скоростью, что также должно способствовать его селективности в отношении целевой ДНК. Данные PBM показывают, что MvaT в целом имеет сходные предпочтения последовательностей ДНК с H-NS и Lsr2. Однако также обнаружено, что MvaT предпочитает AT-богатые последовательности с множественными стадиями TpA и имеет значительную устойчивость к прерываниям пары оснований GC, что является уникальным для MvaT. Наши структурные и функциональные данные показывают, что MvaT использует новый механизм распознавания ДНК, богатый AT, отличный от H-NS и Lsr2, для выполнения функции ксеногенного сайленсинга.

Хотя аффинность связывания ДНК одного ДНК-связывающего домена относительно низка (~ 10 мкМ), полноразмерный MvaT связывает свою геномную AT-богатую целевую ДНК с гораздо более высокой аффинностью из-за поливалентного эффекта, поскольку полноразмерный MvaT олигомеризуется в растворе через свои N-концевые домены [30], и, таким образом, он связывает целевую ДНК, содержащую несколько сайтов связывания, в виде олигомера с несколькими доменами связывания ДНК. В результате энергия связывания каждой полноразмерной молекулы MvaT в нуклеопротеидном комплексе на ДНК определяется не только ее взаимодействием с ДНК, но также ее взаимодействием с соседними молекулами ДНК-связанного MvaT (опосредованного через их N-конец домены), что значительно увеличивает общую стабильность комплекса. Многовалентное взаимодействие широко распространено в биологии хроматина [56], а также используется другими ксеногенными сайленсерами. Значения K _d для H-NS _ctd (~ 9 мкМ) и Lsr2 _ctd (~ 4 мкМ) для связывания 3AT ДНК аналогичны таковым для MvaT _ctd [29], тогда как их полноразмерные белки также связывают ДНК с гораздо более высоким сродством [33, 57]. Мультивалентное связывание, состоящее из индивидуального слабого взаимодействия, более восприимчиво к конкуренции, чем может быть моновалентное сильное связывание [58], что облегчает противодействующим сайленсерам, таким как Ler, ослабление репрессии ксеногенных сайленсеров в регуляции экспрессии генов [59] ].

Структура MvaT _ctd в комплексе с ДНК 3AT показывает, что ДНК-связывающий домен MvaT распознает богатую AT ДНК как через мотив «AT-pincer», вставленный в малую бороздку ДНК, так и через «сеть лизина» с множественными положительными заряды, взаимодействующие с фосфатами остова ДНК. MvaT лишен AT-крючкообразного мотива «Q / RGR», который является критическим для связывания ДНК как H-NS, так и Lsr2, хотя все они специфически нацелены на малую бороздку AT-богатой ДНК. Прогнозы гомологии показывают, что MvaT может иметь структурное сходство с белками семейства H-NS, обнаруженными в Xanthomonadaceae , включая патоген растений Xylella fastidiosa .Выравнивание ДНК-связывающего домена MvaT с разнообразным набором членов семейства H-NS показывает, что MvaT имеет сходство с некоторыми гомологами H-NS в областях, непосредственно N-концевых по отношению к каноническому мотиву H-NS (TW (S / T) G (Q / R) GRTP). Канонический мотив, однако, заменяется другой последовательностью (VIETKGGNH), которая высококонсервативна среди MvaT-подобных белков и отсутствует у членов семейства H-NS (рис. 7A).

Рис. 7. Выравнивание последовательностей и структурное сравнение MvaT _ctd с AT-крючкообразным мотивом, содержащим ДНК-связывающие домены.

(A) Сопоставление Pseudomonas MvaT с членами семейства H-NS выявляет области сходства за пределами канонического мотива H-NS. Выравнивание Clustal Omega С-концевых доменов MvaT и MvaU из P . aeruginosa PAO1 с Bv3F из Burkholderia vietnamiensis G4 (Buv), H-NS из S . typhimurium (Sal), Xanthomonas albilineans (Xan) и X . fastidiosa (Xyl) и Lsr2 из M . Туберкулез . Канонический мотив H-NS заключен в рамку. Жирным шрифтом выделены остатки, соответствующие АТ-крючковому мотиву в Lsr2 и H-NS. (B) Наложение структур MvaT _ctd (голубой) и S . typhimurium H-NS _ctd (пурпурный). Конформации боковой цепи K97 и N100 MvaT _ctd почти идентичны таковым у T110 и R114 H-NS _ctd , соответственно. MvaT _ctd не имеет соответствующего остатка Q112, функционирующего как первый критический остаток AT-крючкообразной структуры «Q / RGR» в H-NS _ctd .Когда MvaT _ctd образует комплекс с ДНК, боковая цепь R80 занимает такое же положение, что и боковая цепь Q112 из H-NS _ctd . Голубой кружок показывает разрыв между боковой цепью R80 и основой loop2. (C) MvaT _ctd / структура комплекса ДНК, если смотреть с одного конца двойной спирали. Полость над парой оснований A6-T19 показана красными сферами.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004967.g007

Общая складка MvaT _ctd аналогична складке H-NS _ctd , хотя относительная ориентация спиралей и β-листа для этих двух белков различны (рис. 7B).Петля 2 MvaT _ctd , содержащая последовательность (KGGNH), на два остатка короче, чем соответствующая петля H-NS _ctd , в которую встроен AT-крючкообразный мотив «Q / RGR» (фиг. 7A и 7B). ). Первый недостающий остаток в MvaT соответствует связыванию малой бороздки «Q / R» мотива «Q / RGR». АТ-крючкообразные мотивы H-NS и Lsr2 вставляются в малую бороздку ДНК, принимая плоскую конформацию с боковыми цепями первого «Q / R» и последнего «R» остатков, вытянутыми в противоположном направлении параллельно второму. паз пол.Однако после связывания MvaT ДНК только Gly99 и Asn100 петли 2 вставляются в малую бороздку и образуют водородные связи с основаниями. Боковая цепь Asn100 имеет такую ​​же конформацию, как последний аргинин мотива «Q / RGR», и, таким образом, остатки MvaT Gly99 и Asn100, по-видимому, функционируют как половина структуры АТ-крючка. Интересно, что роль отсутствующего первого остатка «Q / R» в AT-крючковидном мотиве компенсируется боковой цепью Arg80 из N-концевой области MvaT _ctd , что, таким образом, позволяет MvaT распознавать AT -обогатая малая бороздка ДНК с мотивом «AT-клешня», состоящим из остатков Arg80 и Gly99-Asn100.В результате на границе раздела белок / ДНК имеется полость с минимальным радиусом на 1,2 Å выше пары оснований A6-T19 (рис. 7B и 7C), рассчитанная с помощью CAVERS [60], которая теоретически могла бы вместить экзоциклический NH _{. 2} из пары оснований GC. Это должно объяснять более высокую толерантность MvaT к прерываниям пар оснований GC, как показали наши данные PBM, поскольку малая бороздка ДНК почти полностью занята AT-крючковидными мотивами H-NS и Lsr2.

Недавно было высказано предположение, что как прямое (считывание оснований), так и непрямое (считывание формы) считывание ДНК важно для распознавания ДНК для большинства ДНК-связывающих белков [61, 62].В то время как мотив «AT-клещи» MvaT вставляется в малую бороздку и обеспечивает считывание оснований, боковые цепи нескольких остатков лизина (остатки 81, 83, 97, 102, 105 и 108) MvaT взаимодействуют с сахаром ДНК. фосфатный каркас и представляют собой считывание формы малой канавки. Исследования мутагенеза показывают, что как мотив «AT-pincer», так и «лизиновая сеть» важны для аффинности связывания ДНК MvaT _ctd . Наш функциональный анализ также показывает, что точечная мутация остатка Arg80 или Asn100 мотива «клещей AT», а также остатка Lys105 или Lys108 «лизиновой сети» нарушает функцию MvaT по репрессии фазовой переменной экспрессии cupA. lacZ репортер.Структурное сравнение свободного и связанного с ДНК MvaT _ctd показывает, что большинство ключевых боковых цепей лизина не меняют своей конформации при связывании ДНК, в то время как 3AT принимает почти прямую конформацию с его малой бороздкой, расширенной для связывания MvaT. Это может объяснить, почему MvaT отдает предпочтение гибким последовательностям ДНК с несколькими ступенями TpA по сравнению с ДНК A-тракта. Хорошо известно, что ДНК А-тракта более жесткая и по своей природе изогнута на ~ 15 ° в сторону малой бороздки [49, 53], и поэтому для ДНК А-тракта было бы энергетически затратно открыть свою малую бороздку и принять благоприятная конформация для связывания MvaT.

Заметны различия в искажении ДНК при связывании MvaT и H-NS / Lsr2. Искажение незначительной бороздки наиболее ярко иллюстрируется эукариотическим связывающим белком ТАТА (TBP), который открывает малую бороздку, чтобы раскрутить двойную спираль примерно на 120 °, и сжимает большую бороздку, изгибая ДНК почти на 80 °. Критическим параметром для связывания TBP является не последовательность как таковая, а, скорее, присущая стадия TpA гибкость, которая позволяет белку резко открывать малую бороздку и устанавливать обширные контакты как с фосфатным остовом, так и с основаниями, составляющими основание паз. Искажения, запускаемые в ДНК при связывании с MvaT, значительны, хотя и относительно малы по сравнению с TBP. На другом полюсе находятся эукариотические белки HMG-I (Y), которые содержат узкие и гибкие мотивы АТ-крючка, каждый из которых состоит из мотива R-G-R-P. AT-крючок образует узкую структуру в форме полумесяца, которая вставляется в малую бороздку без значительного искажения траектории спирали [63], что, вероятно, имеет место для H-NS и Lsr2 при связывании ДНК с их AT-крючковидными мотивами.Режим связывания ДНК MvaT наименее похож на Lsr2, который предпочитает ДНК A-тракта с узкой малой бороздкой и в значительной степени нечувствителен к ступеням TpA.

Среди трех семейств бактериальных ксеногенных сайленсеров H-NS и Lsr2 имеют общий механизм распознавания ДНК, похожий на AT-крючок, даже несмотря на то, что они структурно различаются, в то время как последовательность и структурное сходство между MvaT и H-NS предполагают, что они могут иметь общий общее эволюционное происхождение. Любопытно, что MvaT использует особый способ связывания для распознавания сходных, но не идентичных мишеней последовательностей ДНК.Геномный анализ предполагает, что ксеногенные последовательности часто демонстрируют более высокое содержание AT по сравнению с геномом хозяина [64]. Однако среднее содержание AT по всему геному для разных родов бактерий может сильно отличаться, например, ~ 48% для E . coli и S . typhimurium и ~ 34% для M . tuberculosis и P . aeruginosa . Ранее мы сообщали, что доля связанной последовательности из данных ChIP-on-Chip начинает увеличиваться, когда содержание AT достигает ~ 50% для H-NS из S . typhimurium и ∼38% для Lsr2 из M . tuberculosis , которые соответствуют среднему содержанию АТ в соответствующем геноме соответственно [29]. Что еще интереснее, H-NS от S . typhimurium и Lsr2 из M . tuberculosis демонстрируют почти идентичные паттерны связывания, когда содержание АТ в связанной последовательности нормализовано относительно среднего содержания АТ соответствующего генома. Мы предположили, что мотив «RGR» в виде крючка AT используется в основном в ксеногенных глушителях из M . tuberculosis (Lsr2) и B . vietnamiensis (Bv3F), оба с геномами с низким содержанием AT, обеспечивают более прочное связывание с последовательностями с относительно более низким содержанием AT [29]. Для сравнения, мотив «QGR» в виде крючка AT в H-NS из S . тифимуриум и E . coli , оба с геномами с высоким содержанием AT, имеют более низкое сродство к ДНК, слегка богатой AT. Неожиданно оказалось, что аффинность связывания ДНК ДНК-связывающего домена MvaT из P . aeruginosa ниже, чем у Lsr2 из M . tuberculosis , оба с аналогичными геномами с низким содержанием AT, в то время как он аналогичен геному H-NS из S . typhimurium с геномом с высоким содержанием AT. Наши биохимические и структурные исследования показали, что MvaT предпочитает гибкие последовательности ДНК с несколькими стадиями TpA и может лучше переносить вставку GC в последовательности, богатые AT. Из этого может следовать, что Pseudomonas развил MvaT со значительной GC-устойчивостью, чтобы справиться с его геномом с низким содержанием AT.Также возможно, что конкретные особенности, такие как ступени TpA, недостаточно представлены в «основном» геноме Pseudomonas по сравнению с мобильным геномом. До сих пор неясно, почему MvaT из Pseudomonas использует другое решение, чтобы отличить чужеродную ДНК от собственной, и детерминанты могут лежать в подробных характеристиках последовательности его генома.

В то время как предыдущие исследования были в основном сосредоточены на выявлении функционального сходства ксеногенных глушителей от разных бактерий, их различия в значительной степени игнорируются.Очевидно, что способность ксеногенных сайленсеров различных бактерий отличать чужеродные ДНК от собственных ДНК должна зависеть от среднего содержания AT в их соответствующих геномах, и даже возможно, что эти ксеногенные сайленсеры должны точно настраивать свои свойства связывания ДНК. чтобы справиться с различными характеристиками последовательностей собственных геномов и чужеродных ДНК. Необходимы дополнительные исследования для дальнейшего изучения корреляции между молекулярными механизмами ксеногенных глушителей из разных бактерий и характеристиками их геномов.

Материалы и методы

Штаммы бактерий и химикаты

П . aeruginosa штамм PAO1 Δ mvaT cupA lacZ был описан ранее [23]. Е . coli DH5αF’IQ (Invitrogen) использовали в качестве штамма-реципиента для всех плазмидных конструкций. Е . coli штамм BL21 (DE3) использовали для очистки белка.

При выращивании Р . aeruginosa , гентамицин использовали в концентрации 25 мкг / мл для жидких культур и 30 мкг / мл для твердых сред.Колонии репортерного штамма с включенной и выключенной фазой визуализировали после роста на агаре LB, содержащем 75 мкг / мл X-Gal.

Подготовка проб для ЯМР

, кодирующая С-концевой домен MvaT (остатки 77–124) из P . aeruginosa субклонировали в вектор pET21b непосредственно перед кодирующей последовательностью His ₆ -tag. Точечные мутации генерировали с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза (SBS Genetech). Е . coli BL21 (DE3), несущий плазмиду, культивировали в среде LB при 35 ° C, и белок был сверхэкспрессирован путем индукции 100 мкМ IPTG до тех пор, пока OD ₆₀₀ > 1,0. Для изотопного мечения ¹⁵ N и ¹³ C бактерии сначала выращивали в среде LB до OD ₆₀₀ > 0,9, затем собирали и ресуспендировали в ¹⁵ N, ¹³ C-меченой минимальной среде M9 для продолжения роста, и добавляли 100 мкМ IPTG для индукции экспрессии белка через 40 мин.Клетки собирали центрифугированием через 9 ч после индукции и ресуспендировали в буфере для лизиса (50 мМ Трис-HCl, 1 М NaCl, 20 мМ имидазол, pH 9,0), затем лизировали путем замораживания и оттаивания с последующей обработкой ультразвуком. После центрифугирования супернатант, содержащий слитый белок, меченный His, наносили на аффинную колонку Ni-NTA (Qiagen) и элюировали элюирующим буфером (50 мМ Tris-HCl, 1 M NaCl, 250 мМ имидазол, pH 9,0). Белок дополнительно очищали с помощью эксклюзионной хроматографии на колонке superdex 75 (Amersham) в 50 мМ фосфате натрия с 50 мМ NaCl (pH 6.0). Образцы ДНК получали гибридизацией самокомплементарных олигонуклеотидов, сначала нагревали до 94 ° C в течение 5 минут, а затем отжигали путем медленного охлаждения до комнатной температуры. Образцы комплекса белок / ДНК получали смешиванием дуплекса белка и ДНК в соотношении 1: 1.

Отнесения резонанса ЯМР

Образец ЯМР свободного MvaT _ctd содержал ~ 1 мМ однородно ¹⁵ N, ¹³ C — меченый белок в 50 мМ фосфате натрия, 50 мМ NaCl (pH 6,0) с 90% H ₂ O / 10 % D ₂ O вместе с 0.01% NaN ₃ и 0,01% DSS. ЯМР-образец комплекса MvaT _ctd / ДНК содержал ~ 1 мМ 1: 1 комплекс однородно ¹⁵ N, ¹³ C-меченого белка и немеченой ДНК в том же буфере. Все спектры ЯМР были получены при 298 К на спектрометрах Bruker Avance 600, 700 или 800 МГц, оборудованных криозондами тройного резонанса. Химические сдвиги протонов были привязаны непосредственно к DSS. Химические сдвиги ¹⁵ N и ¹³ C были косвенно связаны с DSS.Резонансы основной цепи и алифатической боковой цепи были присвоены 2D ¹ H- ¹⁵ N HSQC, 2D ¹ H- ¹³ C HSQC, 3D HNCACB, 3D CBCA (CO) NH, 3D HNCO, 3D HBHA (CBCA ) (CO) NH, 3D (H) CCH-COSY, 3D (H) CCH-TOCSY и 3D H (C) CH-TOCSY. Ароматические резонансы были назначены с использованием 3D ¹ H- ¹³ C-edited-NOESY, оптимизированного для ароматических резонансов. Резонансы ДНК в комплексе с MvaT _ctd были назначены с использованием 2D F1, F2- ¹⁵ N / ¹³ C-профильтрованный спектр NOESY.Существует единый набор резонансов для двух цепей палиндромного дуплекса 3AT для образца комплекса MvaT _ctd / ДНК, что указывает на то, что процесс связывания происходит быстро по шкале времени ЯМР. Свободные резонансы ДНК были отнесены к спектрам 2D ¹ H TOCSY и 2D ¹ H NOESY. Данные были обработаны с помощью NMRPipe [65] и проанализированы с помощью ЯМР View [66].

Эксперименты по ЯМР-титрованию

Все образцы ЯМР, использованные для эксперимента по титрованию ДНК, равномерно содержали 0,1 мМ ¹⁵ N меченого белка в 50 мМ фосфате натрия, 50 мМ NaCl (pH 6.0) с 90% H ₂ O / 10% D ₂ O. Серия 2D ¹ H- ¹⁵ N HSQC спектров с постепенно увеличивающейся концентрацией ДНК (0,02 мМ, 0,04 мМ, 0,08 мМ, 0,12 мМ, 0,16 мМ и 0,2 мМ) собирали при 298 К на спектрометре Bruker Avance 500 МГц с криозондом тройного резонанса и анализировали изменения химических сдвигов.

2D ¹ H Эксперименты NOESY были проведены для исследования возмущений химического сдвига для ДНК-дуплекса d (CGCATATATGCG) ² образцов с MvaT _ctd или без него на спектрометре Bruker Avance 800 МГц, оборудованном криозондом при 298 К.Образец ЯМР содержал 0,4 мМ ДНК в 50 мМ фосфате натрия, 50 мМ NaCl (pH 6,0) со 100% D ₂ O и лиофилизированный протеиновый порошок MvaT _ctd добавляли до конечных концентраций 0,25 и 0,5 мМ. Анализировали область отпечатков пальцев внутриостаточных кросс-пиков h2’-H6 / H8 NOE.

Для эксперимента по конкуренции с нетропсином равномерно 0,1 мМ ¹⁵ N, меченный MvaT _ctd был смешан с 0,2 мМ дуплексом ДНК в 50 мМ фосфате натрия, 50 мМ NaCl (pH 6,0) с 90% H ₂ O / 10% D ₂ О.2D ¹ H- ¹⁵ N Спектры HSQC были получены с постепенным добавлением нетропсина в концентрациях 0,05 мМ, 0,1 мМ, 0,2 мМ, 0,3 мМ и 0,5 мМ на спектрометре Bruker Avance 500 МГц с криозондом тройного резонанса. .

Определение структуры

Ограничения расстояния были получены из 3D ¹ H- ¹⁵ N-отредактированных NOESY-HSQC и 3D ¹ H- ¹³ C-редактированных экспериментальных данных NOESY-HSQC. Межмолекулярные NOE были получены из 3D F1- ¹⁵ N / ¹³ C-фильтрация, F2- ¹³ C-редакция NOESY и 2D F1- ¹⁵ N / ¹³ C-фильтрация, F2- ¹⁵ N-редактируемые спектры NOESY. Дополнительные межмолекулярные NOE были получены путем анализа спектров NOESY-HSQC 3D ¹ H- ¹⁵ N-редакции и 3D ¹ H- ¹³ C-редакции NOESY-HSQC комплекса MvaT _ctd / ДНК. Белковые ограничения по двугранному углу были получены с использованием TALOS + [67]. Ограничения на боковую цепь χ ^{— 1 угол} были выведены на основе внутриостаточных паттернов NOE.

Для расчета структуры свободного MvaT _ctd исходные структуры были сгенерированы CYANA с ограничениями из модуля CANDID [68].Затем исходные структуры использовались в качестве моделей фильтров для уточнения присвоений NOE и ограничений расстояния с помощью SANE [69]. Эти уточненные ограничения расстояния затем использовались для расчета уточненных структур с модулем DYANA CYANA. Эта процедура выполнялась итеративно, поскольку уточненные структуры могут использоваться в качестве моделей фильтров для следующего раунда расчета SANE-DYANA. Когда не было нарушения расстояния более 0,5 Å, 100 структур с наименьшими значениями целевой функции из 200 структур, рассчитанных с помощью DYANA, были отобраны для дальнейшего уточнения с использованием AMBER 12 [70] с использованием обобщенной модели сольватации Борна (GB) [71]. SANE также использовался для процесса уточнения до тех пор, пока практически не было нарушения расстояния более 0,2 Å и нарушения угла не было больше 5 °. Для представления были выбраны 20 лучших структур с наименьшими энергиями AMBER, средняя структура была получена с использованием SUPPOSE и минимизация энергии с помощью AMBER 12. Качество структур было проанализировано с помощью PROCHECK-ЯМР [72].

Для расчета сложной структуры сначала рассчитывались и уточнялись структуры MvaT _ctd и ДНК отдельно, как описано выше.В дополнение к ограничениям расстояния NOE, теоретические ограничения для B-формы ДНК также использовались при определении структуры ДНК. Углы скручивания основной цепи ДНК α, β, γ, δ, ε и ζ были ограничены диапазонами -60 ° ± 30 °, 180 ° ± 30 °, 60 ° ± 35 °, 130 ° ± 50 °, 225 ° ± 75 ° и -95 ° ± 35 ° (или 180 ° ± 30 °) соответственно. Сморщивание сахара фиксировали на C2’-endo, устанавливая фазовый угол P псевдовращения в диапазоне 135 ° ± 45 °, как реализовано в программе AMBER. Угол гликозидного кручения χ был установлен на антиконформацию со значением -120 ° ± 40 °.Водородные связи использовали для поддержания типичного спаривания оснований Уотсона-Крика. Структура комплекса белок / ДНК была получена и дополнительно уточнена в AMBER 12 с использованием модели сольватации GB путем объединения MvaT _ctd и структур ДНК с межмолекулярными ограничениями NOE. Вкратце, координаты белка и ДНК были произвольно объединены, и сложная структура была рассчитана с добавлением ограничений межмолекулярного расстояния, которые были установлены на 50 Å, и постепенно уменьшались до 20 Å и 8 Å, а затем до фактического удерживающего расстояния, в то время как Вес для ограничения межмолекулярного расстояния был увеличен с 0 до 2 до 20 до 25 ккал / моль · Å ² .Из 100 рассчитанных структур были отобраны и проанализированы с помощью PROCHECK-ЯМР 20 структур с наименьшей энергией AMBER. Средняя структура была получена с использованием SUPPOSE, а энергия минимизирована с помощью AMBER 12. Параметры спирали и бороздок ДНК анализировали с помощью программы CURVES + [73].

Анализ сдвига электрофоретической подвижности

Фрагмент cupA1 размером 340 п.н. амплифицировали с помощью ПЦР из P . aeruginosa геномная ДНК PAO1 с использованием праймеров GT044 (5 ’GCGAAGCCGTGGTTCGAGTTGTT) и GT045 (5’ ATCCCGGCCTCTCTTGCTTGTCTT).Фрагмент гена PA3900 размером 204 п.н. амплифицировали с помощью ПЦР из той же геномной ДНК с использованием праймеров GT049 (CCGCAGGTGGCTGAACA) и GT050 (CGAATGCGGTGCGTTGATGG). Продукты ПЦР радиоактивно метили на 5′-конце γ- ³² P АТФ с использованием полинуклеотидкиназы Т4 (New England Biolabs). Фрагмент ДНК 400 нМ, 4 мкл γ- ³² P АТФ (3000 Ки / ммоль, 10 мКи / мл, Perkin Elmer), 1x полинуклеотидкиназный буфер и фермент полинуклеотидкиназа Т4 (New England Biolabs) инкубировали в общей сложности 40 мкл при 37 ° C в течение 30 мин.Реакцию останавливали добавлением 1 мкл 0,5 М EDTA, и избыток радиоизотопов удаляли с помощью спин-колонки G-25 (GE Healthcare Life Sciences). Смолу спин-колонки ресуспендировали путем встряхивания колонки вверх дном в течение 30 секунд. Колпачок ослабили на четверть оборота и отломили нижнюю крышку. Затем колонку помещали в микроцентрифужную пробирку на 1,5 мл и вращали со скоростью 2800 об / мин (735g) в настольной центрифуге. Затем колонку помещали в свежую микроцентрифужную пробирку на 1,5 мл и проводили реакцию радиоактивного мечения.ДНК элюировали вращением при 2800 об / мин (735 × g) в течение 2 мин в настольной центрифуге. 760 мкл H ₂ O добавляли к конечному объему 800 мкл для разбавления ДНК до рабочего запаса 20 нМ. ДНК разделяли на аликвоты и хранили при -20 ° C. 1 мкл этого исходного раствора даст конечную концентрацию 1 нМ в 20 мкл реакции связывания EMSA. 1 нМ радиоактивно меченую ДНК инкубировали с различными концентрациями белка в связывающем буфере (15 мМ HEPES pH 7,9, 40 мМ KCl, 1 мМ EDTA, 0,5 мМ DTT, 5% глицерин). Добавление различных количеств белка изменяло концентрацию растворенных веществ от пробирки к пробирке. Таким образом, буферные условия были нормализованы так, что каждая реакция содержала 8 мМ Трис pH 8,0, 15 мМ HEPES pH 7,9, 40 мМ NaCl, 40 мМ KCl, 1,4 мМ EDTA, 0,5 мМ DTT, 9,95% глицерина. Реакции связывания инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин перед добавлением избытка холодной (немеченой) ДНК, где это необходимо. Далее образцы инкубировали еще 15 мин при комнатной температуре. 2,5 мкл 10-кратного красителя для загрузки ДНК (10 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 10 мМ ЭДТА, 65% сахарозы, 0,3% бромфенолового синего) добавляли в каждую реакцию, и образцы наносили на 6% природный полиакриламидный гель, который предварительно подвергали обработке. работать в течение 1 часа при 100 В при 4 ° C.Образцы обрабатывали при 70 вольт в течение 165 минут при 4 ° C, сушили в сушилке для геля (Labnet International) в течение 1 часа при 80 ° C и экспонировали в течение ночи на люминофорном экране хранения (GE Healthcare Life Sciences / Molecular Dynamics). Гели визуализировали на следующее утро с помощью тепловизора Typhoon 9400 с разрешением изображения 50 мкм. Кажущуюся константу диссоциации, которая соответствует концентрации белка, когда ДНК наполовину связана, определяли с помощью аппроксимации кривой на основе количественной оценки интенсивности полос несвязанной ДНК.Сообщается среднее значение четырех повторов и их стандартные ошибки.

Микроматрица связывания белков

экспериментов с PBM проводили, как описано ранее [29]. Последовательность кодирования полной длины MvaT из P . aeruginosa клонировали в вектор pTH6838 [74] с использованием метода изотермической сборки [75] для создания вектора, продуцирующего химерный белок с глутатион-S-трансферазой (GST), присоединенным к N-концу MvaT. Данные были проанализированы с помощью специального скрипта Python (написанного и доступного от W.W.N) и построены с помощью пакета визуализации данных ggplot2 [76].

Калориметрия изотермического титрования

ITC проводили с использованием системы MicroCal iTC200 (GE Healthcare) при 283 К. 0,15 мМ ДНК помещали в клетку и титровали MvaT _ctd или его мутантами (2,3–4,2 мМ), введенными аликвотами по 2,4 мкл. Соответствующие контроли «от белка к буферу» были выполнены для коррекции фона. Данные титрования ITC анализировали с помощью Origin 7.0 (OriginLab), поставляемого с прибором.Стандартное отклонение рассчитывалось в соответствии с подгонкой по Origin.

Анализ β-галактозидазы

Ячейки П . aeruginosa были проницаемы с помощью додецилсульфата натрия и CHCl ₃ и проанализированы на активность β-галактозидазы, как описано ранее [77]. Анализы выполняли дважды в трех экземплярах в отдельных случаях. Показан репрезентативный набор данных.

Мутантные векторы экспрессии MvaT-V

Плазмида pPSV-MvaT-V, которая обеспечивает экспрессию WT MvaT с С-концевой меткой гликопротеинового эпитопа вируса везикулярного стоматита (MvaT-V), была описана ранее [30].Сайт-направленный мутагенез mvaT выполняли с помощью ПЦР для введения мутаций, определяющих аминокислотные замены R80A, K81A, K83A, K97A, N100A, K102A, K105A и K108A. Мутантные кодирующие последовательности расщепляли с помощью Bam HI и Xho I и клонировали в pPSV-MvaT-V, разрезанную теми же ферментами, для получения плазмид pPSV-MvaT (R80A) -V, pPSV-MvaT (K81A) -V, pPSV-MvaT (K83A) -V, pPSV-MvaT (K97A) -V, pPSV-MvaT (N100A) -V, pPSV-MvaT (K102A) -V, pPSV-MvaT (K105A) -V и pPSV-MvaT (K108A) ) -V.

Вестерн-блоттинг

Продукция белков MvaT-V была подтверждена вестерн-блоттингом с использованием антитела против VSV-G (Sigma-Aldrich). Антитело против α-субъединицы РНК-полимеразы (Neoclone) использовали для контроля различий в загрузке белка.

Вспомогательная информация

S1 Рис. Структурные параметры, предсказанные DNAshape для MvaT-связанных 100% AT 8-мерных последовательностей с максимальными 20 (левая панель) и самыми низкими 20 (правая панель)

Параметры спирали не рассчитываются для двух оснований на обоих концах 8-мерной последовательности.

https://doi. org/10.1371/journal.ppat.1004967.s001

(TIF)

S2 Рис. Назначение резонансов для MvaT

2D ¹ H- ¹⁵ N Спектры HSQC свободного (A) и ДНК-связанного MvaT _ctd (B). Назначения обозначаются однобуквенным кодом аминокислоты и порядковым номером. Область отпечатка пальца 2D ¹ H NOESY-спектры свободного (C) и связанного с белком (D) дуплекса ДНК 3AT.Пики H2’-H6 / H8 NOE в остатках помечены базовым типом и номером, а последовательная связь показана линиями.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004967.s002

(TIF)

S3 Рис. Влияние одиночной мутации на структуру MvaT

Наложение 2D ¹ H- ¹⁵ N Спектры HSQC R80A (A), K81A (B), K83A (C), K97A (D), N100A (E), K102A (F), K105A ( G) и K108A (H) (красный) с тем из WT MvaT _ctd (черный).Для K83A сигналы NH плохо диспергированы, что указывает на то, что белковая складка K83A может быть изменена. Для других мутантов большинство затронутых сигналов NH происходит от остатков, близких к сайту мутации. Остатки, демонстрирующие значительные изменения химического сдвига, обозначены однобуквенным кодом аминокислоты и номером остатка.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004967.s003

(TIF)

S4 Фиг. Влияние одиночной мутации на связывание ДНК MvaT

Наложение 2D ¹ H- ¹⁵ N HSQC спектров с различным соотношением ДНК / белок для WT MvaT _ctd (A), R80A (B), K81A (C), K97A (D), N100A (E ), K102A (F), K105A (G) и K108A (H).Отношения ДНК к белку: 0 (черный), 0,2 (красный), 0,4 (зеленый), 0,8 (синий), 1,2 (желтый), 1,6 (пурпурный) и 2,0 (голубой).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004967.s004

(TIF)

S5 Рис. Подгонка кривой ITC для WT MvaT

Изотермы связывания калориметрического титрования WT MvaT _ctd (A), R80A (B), K81A (C), K97A (D), N100A (E), K102A (F), K105A (G) и K108A ( H) к AT-богатой ДНК. (I) Изотерма связывания калориметрического титрования WT MvaT _ctd с GC-богатой ДНК.Показаны термодинамические параметры, полученные в результате этих экспериментов по титрованию (вставка).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004967.s005

(TIF)

Благодарности

Мы благодарим Эмили Бекетт-Суард за создание слитых конструкций GST-MvaT, используемых в микрочипах связывания белков, и Блэра Гордона за предварительный анализ данных PBM. Мы благодарим Zhenhua Ming, Ruifeng Yao, Wei Tang и Hongduan Huang за их помощь в измерениях сродства связывания, а также Renate Hellmiss и Bryan McGuffie за помощь с иллюстрацией на рис.6.Все эксперименты ЯМР проводились в Пекинском центре ЯМР и в центре ЯМР Национального центра белковых наук при Пекинском университете.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: PD TRH JL SLD WWN BX. Проведены эксперименты: ПД КАМ СЖ ГТ БД АЙ. Проанализированы данные: PD KAM GT BD TRH JL SLD WWN BX. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты для анализа: JL SLD WWN BX. Написал бумагу: PD KAM GT SLD WWN BX.

Ссылки

— Rich Cutler Sound Mix + Design

Обладая более чем 30-летним опытом, Rich Cutler является аудиомикшером, номинированным на премию Эмми, и является залогом успеха. В условиях меняющегося рынка он обладает способностью обрабатывать обширный звуковой дизайн, а также микшировать для широкого спектра потребностей. Рич приносит с собой навыки, необходимые для успешного управления проектами, которые позволят выполнить задачи в самые напряженные сроки.Качество всегда превыше всего — без компромиссов. Одним из многих аспектов талантов Рича, которые отличают его от других, являются его сильные стороны в технических аспектах управления успешным аудиооборудованием в сочетании с сильными знаниями в области поиска и устранения неисправностей. Его компания Rich Cutler Sound Mix & Design, Inc. была основана в 2007 году и надеется на продолжение отношений и налаживание новых, в которых цель пути — удовлетворение потребностей клиентов и качество продукции.

Это жизнь с Лизой Линг: серия , звукорежиссер, микшер для перезаписи, 2017

Место преступления: серия , звуковой дизайнер, микшер для перезаписи, 2017

Food Paradise: серия , звук Дизайнер, перезаписывающий микшер, 2017

We Will Rise Documentary : звуковой дизайнер, перезаписывающий микшер, 2016

Trisha’s Southern Kitchen : перезаписывающий микшер, 2016

Car Stars Web Series : звуковой дизайнер , Микшер для перезаписи, 2016

Steven Be Web Series : звукорежиссер, микшер для перезаписи, 2016

Прямой эфир из Линкольн-центра : микшер для перезаписи, 2013-2016

Линкольн-центр в кино : микшер перезаписи, 2015

документальный фильм Ньюмана : звукорежиссер, микшер перезаписи, 2015

круиз: художественный фильм, редактор диалогов, звукорежиссер, микшер перезаписи, компания mpleted 2016

50 Shades of Greige : короткометражка, звуковой дизайнер, микшер для перезаписи, 2016

Kosher Soul : телесериал, микшер для перезаписи, 2015

The New Yorker Presents : документальный сериал , Звукорежиссер, микшер для перезаписи, 2015

Over My Dead Body : телесериал, пост-продакшн аудио, 2014

Like Sunday, Like Rain : Sound Design and Mix, 2014

The Approval Matrix : сериал, микшер для перезаписи, 2014

Spartan Race Reebok : мини-сериал, микшер для перезаписи, 2014

Trust Me, I’m a Lifeguard : Short, Sound Mixer, 2013

Импровизация: 50 лет за кирпичной стеной : телевизионный документальный фильм, аудиомикс, 2012-2013

Oddities : телесериал, микшер для перезаписи, 2013

Playing With Fire : телесериал, пост Аудиомикшер, 2013

Comic Book Men : TV Series, Post Audio Mixer, 2012-2013

Kimberly’s Simply Southern : TV Series, Post Audio Mixer, Sound Designer 2012-2013

Fix My Family : TV Series, Post Audio Mixer , 2013

Подсчет автомобилей : телесериал, микшер для перезаписи звука, 2012

заброшенный : телесериал, микшер для перезаписи звука, 2012

мама-подросток : телесериал, микшер для перезаписи звука , 2012

Empire Girls : Julissa & Adrienne : TV Series, Post Audio Mixer, 2012

Oddities San Francisco : TV Series, Sound Re-Recording Mixer, 2012

Cajun Pawn Stars : TV Series, микшер для перезаписи звука, 2012

Truck Stop Missouri : телесериал, микшер для перезаписи звука, 2012

Oddities : телесериал, микшер для перезаписи звука, 2012-2013

Girlfriend Confidenti al: LA : ТВ-фильм, Post Sound Mixer, 2012

Birds of Brooklyn : Short, Sound Mixer, 2012

Monster in-Laws : TV Series, Post Audio Mixer, 2011

Fashion Hunters : TV Series, Post Audio Mixer, 2011

I Do Over : TV Series, Post Audio Mixer, 2011

Сохранено : Документальные сериалы, Post Audio Mixer, 2011

Не перышко, а точка : Документальный, Post Audio Mixer, 2011

An American Life: The Journey from Violence to Hope : Documentary, Post Audio Mixer, 2011

Detour : Звукорежиссер, звуковой редактор, микшер для перезаписи звука, 2011

The Haunted : документальный сериал, Post Audio Mixer, 2010-2011

Psychic Kids: Children of the Paranormal : документальный сериал, Post Audio Mixer, 2010

My Life in Food : TV Series, Post Audio M ixer, 2010

Эй, смотрите этот : Видеофильм, микшер для перезаписи звука

Обезьяна, сними маску! : Короткий, перезаписывающий микшер

Fall, Short : звуковой редактор, перезаписывающий микшер

Last Day of Summer : редактор диалогов, звуковой дизайнер, микшер для перезаписи звука, 2009

Сток Дракулы : Документальный фильм, Звук спецэффектов, 2009

D.E.A. : сериал, звукорежиссер — 9 эпизодов-2009, микшер для перезаписи звука — 9 эпизодов-2009

ожидание Армагеддона : документальный фильм, звуковой микшер, 2009

No Dog Left Behind : короткометражный документальный фильм, публикация Audio Mixer, Sound Designer, 2009

Sweet Nothing : Short, Re-Recording Mixer, 2009

I Love the New Millennium : TV Mini-series, Post Audio Mixer, 2008

Karma Police : Сообщение Audio Mixer, 2008

The Gamekillers : сериал, Post Audio Mixer, 2007

Iconoclasts : Документальный сериал, Post Audio Mixer, 2005–2007

Wade in the Water : Children, Documentary, Post Audio Mixer, 2007

Mad Men : TV Pilot, Re-Recording Mixer, Dialogue Editor, Sound Designer, 2007

Rockaway : Dialog Editor, 2007

Fast Cars and Superstars: The Gillette Young Guns Celebrity Race : телесериал, звукорежиссер, микшер для перезаписи, 2007

The Polymath, или Жизнь и мнения Сэмюэля Р.Делани, Джентльмен : документальный фильм, микшер Post Audio, 2007

I’m No Stud : Short, Post Audio Mixer, 2007

Sportsfan : телевизионный документальный фильм, микшер для перезаписи, 2006

Black and White : Портрет Шона Комбса ,: телевизионный документальный фильм, перезаписывающий микшер, 2006

Пластиковые катастрофы : телевизионный документальный фильм, пост-аудиомикшер, 2006

Десять дней, которые неожиданно изменили Америку : документальный телесериал, пост-аудио Mixer, 2006

Fade To Black : Sound Editor, 2005

Gamekillers : TV Movie and Series, Post Audio Mixer, Sound Designer, 2005-2006

Fuse Hot 97 Summer Jam : Музыкальный редактор, Post Audio Mixer, 2004

Battlegrounds: King of the Court : документальный сериал, Post Audio Mixer, 2004-2005

Super Bowl XXXVIII : Sound Designer, Post Audio Mixer, 2004

The NFL Today : телесериал, звукорежиссер, микшер Post Audio, 2000-2004

SportsCentury : величайшие атлеты века : телесериал, перезаписываемый эпизод Mixer-1, 2002

Darryl Strawberry : Re — Recording Mixer, 2002

History Undercover: Road Map to Pearl Harbor : ТВ документальный фильм, микшер для перезаписи, 2001

ABC Weekend Specials : сериал, эпизод Post Audio Mixer-1, 1995

Crash Curiousaurus : Post Audio Mixer, 1995

Кто этот человек? : Assistant Dialogue Editor — в титрах не указан, 1993