Комплексы человека: Какие бывают комплексы? — Блог Викиум

Какие бывают комплексы? — Блог Викиум

Почему у человека глаза горят? Это тараканы в его голове что-то празднуют… Что ж, такова жизнь: у всех людей есть свои психологические комплексы. Но это не просто милые странности, а глубокое явление — система представлений о мире, самом себе, комплект персональных реакций и паттернов поведения.

Может ли человек сам побороть комплексы? Да, но если будет действовать по всем фронтам и по науке. Рассказываем, как — на примере пяти самых распространенных людских заморочек.

Комплекс неполноценности

Это самый часто встречающийся комплекс — перманентное чувство собственной ущербности, дефектности, несовершенства. Это сказывается на всех жизненных сферах, а также на здоровье и взаимоотношениях с людьми.

Причем нередко от этого комплекса страдают как раз очень талантливые, выдающиеся люди. Причина — в излишней самокритичности и самооценке «ниже плинтуса». Но эти проявления человек воспринимает как норму…

Ученые говорят о двух видах неполноценности: первичная формируется в детские годы из-за невозможности повлиять на обстоятельства. Также же она может быть вызвана неграмотным поведением родителей — например, если они постоянно сравнивают своего ребенка с другими, не хвалят, критикуют.

Вторичная неполноценность нарастает, когда уже взрослые люди не могут достичь целей, которые сами себе установили, дабы компенсировать то чувство неполноценности, которое сформировалось у них в детстве.

Здесь опять же очень важно разобраться в причинах. Если комплекс надуман, психолог поможет заменить деструктивные убеждения о себе на более здоровые. Если же человеку вправду недостает ассертивности или социальных навыков, необходимо нарабатывать все это.

Чтобы планки, которые люди ставят перед собой, были адекватными, важно уметь грамотно формулировать цели. Здесь очень поможет прохождение курса Викиум «Целеполагание».

Комплекс вины

Ощущать вину — естественно для человека (если он что-то натворил). Но если некто чувствует виновность, совершенно непропорциональную совершенной ошибке, то это уже «токсичное» расстройство, базирующееся на искаженном восприятии действительности.

Причем психологический комплекс вины возникает даже в умозрительных ситуациях: когда человек полагает, что навредил кому-то или пожелал зла; когда он только подумал о том, как бы что-то натворить — например, нафантазировал себе любовное приключение с коллегой; когда уверен, что приложил недостаточно усилий и способен на большее; когда ему хорошо, если другим плохо.

Конечно, умеренное ощущение виновности может мотивировать человека исправить ситуацию, сделать что-то хорошее для окружающих и впредь так не поступать. А вот отравляющая психику вина только деструктивна — к этому чувству могут примешаться другие психологические (тревожность, депрессия) и соматические проблемы (бессонница, нарушение пищеварения, боли в теле, мигрени и пр.).

Вот почему важно как можно быстрее проработать такие внутренние установки. Здесь поможет психотерапия, подкрепленная упорной работой над собой. Важно познать и применять экологичные алгоритмы мышления и поведения, научиться управлять эмоциями.

Важные знания и инструментарий вы можете почерпнуть в курсах Викиум «Детоксикация мозга» и «Эмоциональный интеллект» — современный подход на основе достижений нейропсихологии поможет разобраться в себе (и окружающих тоже), управлять эмоциональным фоном, противостоять стрессу и вообще не допускать его в свою жизнь.

Комплекс превосходства (мания величия)

Человек, мучимый им, уверен, что он не просто хороший, а лучше всех на свете — к другим людям он относится с пренебрежением, высокомерием, раздутым величием. Он готов общаться лишь с теми, кто сулит ему какую-то выгоду. И, конечно, убежден в том, что у него, такого исключительного, есть и особые права.

Кстати, любопытно, что данный комплекс появляется изначально для того, чтобы компенсировать комплекс неполноценности. Но если вовремя не остановиться, его форма, объемы и выражение станут извращенными и неадекватными.

Эдипов комплекс и комплекс Электры

О них первым заговорил Фрейд, когда усмотрел сексуальную природу в особой привязанности мальчиков к матери, а девочек — к отцу. Люди с такими комплексами, как правило, отстают в эмоциональном развитии, инфантильны, имеют сложности в отношениях с представителями противоположного пола. Партнера они постоянно сравнивают с идеалом (родителем).

Комплекс мученика

Его носитель может проживать чувства только через страдание, и так и притягивает к себе сложные ситуации.

Однако от синдрома жертвы данный комплекс все же отличается. «Жертва» уверена, что страдает несправедливо, но сам процесс доставляет ей удовольствие, и такие люди не предпринимают никаких мер, чтобы выпутаться из ситуации.

А «мученик» нарочно попадает в такие травмирующие истории — таким образом он удовлетворяет свои искаженные эмоциональные потребности. Так как он приносит себя в жертву ради других, то его все время сопровождают гнев, обида, бессилие. Наглядные примеры можно увидеть в созависимых отношениях или там, где имеет место насилие.

Читайте нас в Telegram — wikium

Распространенные комплексы и их преодоление. Часть 1

Психологические комплексы – весьма распространенное явление. Можно сказать, что практически у каждого человека есть свои «тараканы в голове», а у кого-то и серьезная психологическая проблема, омрачающая жизнь. Как можно понять из названия, комплекс – это не просто какая-то странность в поведении, а это целая совокупность элементов: представлений о себе, убеждений и воззрений, эмоций и паттернов реакций, моделей поведения и компенсаций. Неудивительно, что и бороться с комплексами бывает сложно, потому что рациональный подход и метод «перестань об этом думать» малоэффективен, так как не затрагивает весь спектр компонентов проблемы.

Чтобы лучше понимать динамику и структуру этого феномена, рекомендуем вам ознакомиться со статьей «Как избавиться от комплексов» и другими материалами по теме на сайте. Если же корни проблемы глубоко проросли в психику, и кажется, что с такой ношей самому не справиться, лучше всего обратиться к специалисту за профессиональной помощью. Однако во многих случаях с тем, что мы называем комплексами, возможно поработать самому и получить прекрасные результаты. Ниже мы рассмотрим те практические шаги и инструменты, которые дают возможность искоренить эти ядовитые психические образования.

Однако вначале нужно разобраться, с чем мы имеем дело. Комплексы не всегда бывают очевидны и для своего обладателя, который настолько свыкается с ними, что начинает воспринимать свою проблему, как нечто нормальное и неотделимое от себя. Часто человек страдает от какого-то «затыка», не осознавая, что его нужно и можно убрать, вернув себе право жить полноценной и счастливой жизнью.

Тема комплексов обширна и включает большое количество различных феноменов. Узнать больше о том, какие из них присущи сильной и прекрасной половине человечества, можно из статьи о женских и мужских комплексах. А сегодня давайте посмотрим лишь на пять распространенных комплексов.

Комплекс неполноценности

Пожалуй, самый известный из всех комплексов и, к сожалению, весьма распространенный. Ему подвержены и мужчины, и женщины, причем не только самые слабые и безвольные. Отличительная черта этого комплекса – стойкое ощущение и восприятие себя как ущербного, неполноценного, неправильного. Человек с таким самоощущением видит себя как дефектный, недоделанный или недоукомплектованный товар, тогда как люди вокруг видятся нормальными и полноценными. Такая нездоровая искаженная модель мировосприятия и мироощущения накладывает свой разрушительный отпечаток на все сферы жизни: его самооценку и психическое здоровье, физическое здоровье, взаимоотношения, работу и карьеру, поведение и самопроявление в мире.

Очень часто страдают от комплекса неполноценности самые замечательные и способные люди. Их излишняя самокритичность и заниженная самооценка не воспринимаются ими как необъективные и нездоровые, что удерживает их в клетке переживаний и удушающего неверия в себя.

Австрийский психолог и психотерапевт Альфред Адлер ввел это понятие в оборот и выделял два вида неполноценности:

• Первичная неполноценность развивается в детстве от ощущения собственной беспомощности и неспособности повлиять на ситуацию. Может быть вызвана и усилена тем, что родители сравнивают ребенка с другими не в его пользу, много ругают и критикуют, не дают позитивной оценки.
• Вторичная неполноценность расцветает в тех ситуациях, когда уже взрослый человек не достигает целей или не берет высокую планку, которые установил себе, чтобы компенсировать чувство неполноценности, усвоенное в детстве.

Глубокое ощущение себя ущербным и неполноценным может быть результатом пережитой травмы или абьюза. Потому очень важно разобраться в причинах и природе своего комплекса, и в первую очередь в том, действительно ли имеется какой-то дефицит или же он надуманный.

В случае, если комплекс неполноценности абсолютно необоснован, работа с ним будет сосредотачиваться на замене деструктивных и иррациональных самоопределений, убеждений и моделей мышления на более адекватные и здоровые. В случае, если человеку действительно чего-то не хватает, например, навыков ассертивности или социальных умений, нужно восполнить эту нехватку и затем укрепить более позитивные убеждения о себе.

В самых общих словах, исцеление приходит через вычленение «больных» шаблонов мышления, осознание их несправедливости и трансформацию в более здоровые. Человек сможет обрести полное психическое здоровье и благополучие, только если научится относиться к себе с принятием, уважением, сочувствием и поддержкой – так же, как к хорошему другу. Не обязательно быть совершенным или самым-самым, чтобы друзья принимали и любили вас. Так и с собой – можно иметь недостатки и слабые стороны, но при этом иметь право на доброе к себе отношение.

Если вы узнали в описании комплекса неполноценности себя и желаете лучше разобраться в его природе и способах искоренения, советуем вам прочитать подробную статью о нем.

Комплекс превосходства

В этом случае человек считает себя лучше и выше остальных. Пренебрежительное и высокомерное отношение к другим людям как своего уровня, так и вышестоящим, выпирает и проявляется и на словах, и в поступках. Такой человек общается лишь с теми, с кем ему выгодно или стратегически полезно водиться. Но главная отличительная черта этого явления не поведение, а самовосприятие – те, у кого есть комплекс превосходства, убеждены в своей исключительности и особых правах.

Несмотря на кажущуюся противоположность комплексу неполноценности, данный комплекс может быть его обратной стороной. Альфред Адлер, описавший данное явление впервые, указывал на то, что комплекс превосходства развивается для компенсации комплекса неполноценности, и, по сути, является его извращенной формой.

С другой стороны, психологи считают, что вырастает этот комплекс из интенсивных ощущений и эмоциональных состояний, в результате которых человек чувствует свою особенность и превосходство над другими. Такие эмоции и мысли перерастают в особенность психики. Интересный факт: исследователи отмечают, что до 10% здоровых людей могут иметь мысли о своем величии, однако не подпадают под критерии мании величия [Knowles, McCarthy-Jones, Rowse, 2011].

Эдипов комплекс/Комплекс Электры

Под этим комплексом понимается особая привязанность или влечение к родителю противоположного пола. Во фрейдистской теории такие тенденции у мальчиков по отношению к маме (эдипов комплекс) и у девочек – к отцу (комплекс Электры) имеют сексуальную природу. А по мнению ученого Бронислава Малиновского – социальную.

В любом случае наличие данного комплекса крайне нежелательно – оно приводит к отставанию в эмоциональном развитии и инфантильности. Более того, мужчина-Эдип, как и девушка-Электра, испытывают трудности в отношениях с противоположным полом. У них нездоровые и неадекватные ожидания от потенциальных партнеров, которых они сравнивают с идеалом – своим родителем. К сожалению, с таким комплексом практически невозможно стать счастливым в личной жизни, и потому с ним нужно распрощаться.

Здесь важно уточнить, что в современной психологии оба данных понятия, предложенных Фрейдом, не являются общепризнанными и довольно спорны. Комплекс Электры, в частности, не признается как официальный диагноз и подвергается критике некоторыми психологами. Тем не менее, оба комплекса широко известны, и о них стоит знать.

Комплекс мученика

Человек с комплексом или синдромом мученика живет ради тех чувств, которые проживает через свои страдания. Он неосознанно выискивает и притягивает к себе ситуации, в которых подвергается преследованию или несправедливости, которые питают его мученичество. Такое поведение вырастает из искаженной психологической потребности.

Комплекс мученика проходит очень близко с синдромом жертвы, и оба термина могут использоваться синонимично. В русскоязычной литературе чаще встречается второй вариант названия комплекса. Обыкновенно, любые проявления страдальчества и беспомощности относят в категорию «жертва». Однако же психологами отмечаются тонкие различия между двумя этими психологическими явлениями:

• Человек с мышлением жертвы обычно считает, что пострадал от чего-то плохого или несправедливого. Его раздирают неприятные чувства от такого незаслуженного зла, даже когда какое-то досадное происшествие или проблема были объективной случайностью или же чье-то грубое поведение не было личным выпадом. Такие люди обычно не проявляют особого интереса к возможным решениям и исправлению ситуации, а зацикливаются на неприятном эпизоде и своих негативных эмоциях. Создается впечатление, что они только и хотят, что пострадать.
• В случае синдрома мученика человек не ограничивается тем, что считает себя жертвой какой-то ужасной несправедливости или досадного происшествия. Он ищет и находит ситуации, в которых испытывает сильные чувства боли и страдания (конечно же, бессознательно). Тем самым он сам превращает в свою жизнь в бесконечную череду боли и мучений.

Таким образом, «мучеником» движет неосознаваемая деструктивная программа подвергать себя болезненным и травмирующим ситуациям для удовлетворения своих нездоровых эмоциональных потребностей. В итоге такой человек приносит свои интересы и благополучие в жертву ради других людей или дела. Это оставляет его с постоянными и неизбывными эмоциями гнева, обиды и бессилия. Часто невысказанные слова и невыраженные эмоции выходят наружу в виде пассивной агрессии или вспышек злости. Много примеров мучеников и мучениц можно найти в созависимых и абъюзивных отношениях.

Комплекс вины

Чувство вины присуще всем людям и вполне естественно, если человек совершил что-то плохое намеренно или неумышленно. Однако же в случае комплекса вины это ощущение собственной виновности и сожаления непропорционально ошибке или «плохости» и перерастает в расстройство, отравляющее жизнь. Такой человек мучается из-за того, что поступил нехорошо или сделал что-то неправильно, а также и от того, что всегда совершает что-то плохое или приносит другим вред. Сильное чувство вины присутствует у такого человека, даже если он не принес никому боли, ущерба или страданий, и даже если другая сторона не считает его поведение таким ужасным.

В данном случае эмоции и переживания неадекватны ситуации, а восприятие человека сильно искажено и неконструктивно. Человеку, у которого не возникает такого нерационального, стойкого и разъедающего чувства вины на постоянной основе, сложно понять того, кто живет с ним. У «вечно виновного» коктейль жгучей вины, стыда за себя и сожаления возникает постоянно в ситуациях, где он:

1. Действительно сделал что-то неправильное (идущее вразрез с его личными или морально-этическими нормами и стандартами), например, когда он поцарапал чужую машину и ничего не сделал по этому поводу, или накричал на кого-то, выплеснув свои эмоции.
2. Думает, что сделал что-то неправильное и причинил кому-то вред, или просто пожелал кому-то зла.
3. Подумал о том, чтобы сделать что-то «плохое», например, пофантазировал об интрижке с привлекательной коллегой или захотел нагрубить кому-то из близкого окружения.
4. Считает, что мог сделать больше, чем сделал для других. В таком случае человека мучает совесть, что он не поступил максимально благостно, чтобы кому-то помочь, и, по его мнению, сделал недостаточно.
5. Думает о том, что ему хорошо, когда другим плохо, и испытывает вину перед теми, кто более обделен.

Если умеренное и пропорциональное чувство вины и может быть полезным – подталкивая человека компенсировать проступок или в будущем принимать лучшие решения, то хроническая вина неадаптивна и разрушительна. Человек, страдающий от комплекса вины, может начать страдать от других психических проблем, таких как тревога или депрессия, так же как и от соматических симптомов, таких как проблемы со сном или пищеварением, боли в животе или мышцах, головные боли или слезливость.

В общем, комплекс вины, как, впрочем, и другие, не проходит бесследно для психического и физического здоровья. Более того, такие неадаптивные и неконструктивные модели поведения и психики мешают жить полноценной жизнью, реализуя свой потенциал и принося пользу миру, не говоря о том, чтобы наслаждаться собой и своей жизнью. Потому критически важно «вырасти» из них.

Существует множество способов, помимо психотерапии, которые позволяют преодолеть комплексы и психологические проблемы самостоятельно. Они подойдут тем, кто настроен серьезно и готов уделить силы и внимание выполнению практических упражнений и техник. На них мы подробно остановимся в следующей статье и раскроем то, как можно освободиться от вышеперечисленных комплексов без помощи специалиста.

В заключение

Психологические комплексы встречаются часто и значительно омрачают жизнь своим владельцам. По своей сути они являются искаженными паттернами мышления и восприятия и приводят к неэффективному поведению в жизни.

Освободиться от комплексов можно в процессе психотерапии или последовательной самостоятельной работы. Для этого человеку нужно освоить новые, более здоровые и благоприятные, модели мышления, самовосприятия и поведения, а также во многих случаях научиться навыку управлять своими эмоциями. Лучше всего делать это с помощью таких специализированных инструментов, как, например, наша онлайн-программа «Психическая саморегуляция», которая позволяет научиться управлять своим психоэмоциональным состоянием и лучше справляться со сложными стрессовыми ситуациями. Рекомендуем попробовать!

Желаем вам психического здоровья и благополучия!

Недостатки и комплексы человека — Елена Шипилова

Комплексы человека — это внутренние ограничения, установки, которые мешают быть собой настоящим, быть аутентичной, живой, чувствующей, переживающей, выразительной личностью, которой ВЫ, на самом деле, являетесь.

Недостатки человека — наши особенности, которые мы воспринимаем как слабости, например, лень, лысина, трусость, косноязычность.

Человеческие недостатки и комплексы — это то, что мешает жить, наслаждаться жизнью, быть реально свободным и открытым. Они чрезвычайно разнообразны и озвучиваются очень по-разному, но всегда сопровождаются неприятными чувствами — обидой, гневом, опустошением, виной, стыдом и др.

Приходилось слышать такие грустные фразы в устах самых разных людей: «Чувствую себя несчастной и бессильной», «я часто чувствую себя виноватой», «хочу стать кем-то другим», «я хочу сломать себя», «когда люди на меня смотрят я начинаю нести бред, а потом упрекаю себя за это», бывают просьбы и мольбы «загипнотизируйте меня, чтобы я стал другим», «если бы можно было стереть память»…

Наиболее распространенные комплексы человека — неполноценности и вины.

Как определить комплексы человека

Речь идет о комплексе, если вы:

• часто и сильно переживаете из-за собственного поведения, характера, внешности;
• вините себя или окружающих;
• испытываете чувство мешающей скованности при выполнении деятельности, которая оценивается другими людьми;
• считаете, что ваши родители допустили ошибки, воспитывая вас, что теперь влияет на всю вашу жизнь;
• считаете, что вас трудно полюбить;
• стремитесь к некому недостижимому идеальному образу.

Если оставлять без внимания свои комплексы, то ситуация будет постепенно ухудшаться.  Портятся отношения с близкими, исчезают старые друзья, новые не появляются, нет места любви или нет возлюбленной/возлюбленного, начинаются трудности на работе, нет карьерного роста и так далее и тому подобное.

То есть качество жизни значительно ухудшается, даже если мы не берем такие крайности, как появление симптомов большой психиатрии — неврозов или психозов.

Что делать с комплексами и недостатками?

Комплексы и человеческие недостатки изживают.

Первый шаг — осознание своих комплексов.

Дело в том, комплексы, как правило, не осознаются людьми. Часто мы объясняем наше поведение какими-либо «объективными» обстоятельствами, не понимая, что нами управляет наш «внутренний ограничитель». Выход на «поверхность», осознание комплекса или недостатка, как правило, болезненно, потому и психика предпочитает «закрыть глаза». Но неосознанные комплексы сильно влияют на наше поведение. Как только мы понимаем, распознаем комплекс, только тогда с ним можно что-то сделать — изменить.

Например, комплекс неполноценности выражен установкой «у меня некрасивая внешность». Такая установка влияет на поведение, человек считая себя некрасивым и непривлекательным, ведет себя неуверенно, боится знакомиться, чувствует себя неудачником.

Нужно сначала понять, что нечто, что вам мешает быть удачливее, находится в голове. Сначала нужно полюбить себя, свое тело таким, какое оно есть, тогда меры по улучшению своей внешности будут лишь приятным дополнением.

Второй шаг — эксперимент.

Комплексы и человеческие недостатки состоят из установок, например, «я старею», «у меня плохой характер», «меня нельзя полюбить» и др. Допустим мы определили свои установки, и дальше что делать с комплексами? Наша задача не только распознать установки, отлавливать их, но и планировать и проводить эксперименты по опровержению негативной установки. Это работа требует не только воли, но и воображения, терпения и усидчивости.

Например, возьмем тот же комплекс «у меня некрасивая внешность» и спросим у 30 незнакомых людей, что они думают когда смотрят на мою внешность? Часто оказывается так, что наши установки и реальность различаются кардинально. И убедить себя за один раз почти невозможно. Комплекс выращивался годами, служил легким объяснением жизненных неудач, от него трудно избавиться. Но это не повод жить с комплексами дальше.

Если вы подозреваете у себя комплекс, боретесь с недостатком, найдите возможность проконсультироваться с психологом.

По-настоящему важно только одно: согласны ли вы оставаться со своими комплексами или готовы над ними работать. Ни один человек, сколь бы уверенным и успешным он ни казался, не избавлен от внутренних противоречий.

 

Какие комплексы бывают у человека, список

. 

Практически все люди в мире страдают комплексами. Иногда эти комплексы помогают и подталкивают нас к достижению поставленных целей, но часто они служат камнем преткновения на пути к исполнению мечты, в отдельных случаях превращая жизнь в настоящий ад. Это неправильное представление личности о своих недостатках или каких-либо качествах, которые она склонна преувеличивать. Обычно такую странность сопровождают различные переживания, которые индивидуум скрывает от посторонних и близких людей.

Причины и появление

Главными причинами комплекса являются травмы и проблемы в прошлом и связанные с ними эмоции, ощущения, мысли и средства защиты от боли. Источниками неверного мнения о себе являются:

• семья;
• друзья;
• общество;
• важные люди;
• опыт.

В детстве ребенок воспринимает всю информацию, которую получает от окружающего мира, поэтому в этом возрасте он не может критически мыслить, и любое отрицательное мнение, сказанное в его адрес, откладывается в памяти и формирует комплекс. Эта психологическая проблема может остаться навсегда с личностью, даже если она осознает, что это не так и желает избавиться от него. Помимо их возникновения в раннем возрасте, отрицательное мнение о себе закрепляется глубоко в сознании и воздействует на психику личности.

Однако, психологические комплексы могут быть не только отрицательными. Если мнение создается вокруг положительного эффекта, то и реакция на него будет позитивной.

Признаки

Существует несколько общих признаков появления комплексов у человека:

• повышенное переживание по поводу своего поведения;
• пристальное внимание на неадекватные действия в качестве реакции на поступки других людей;
• излишняя скованность в психологическом и физическом плане при сравнении с другими;
• повышенное беспокойство, связанное со встречей со значимыми людьми;
• нетипичные для уравновешенного индивида реакции на различные ситуации и людей.

Отдельно каждый из этих признаков не значим, но в совокупности это симптомы проявления различных комплексов или недостатков, которые личность тщательно скрывает от внешнего мира.

Виды комплексов

Какие бывают комплексы у человека и на какие группы они разделены? Как было сказано выше, относительно влияния комплексы делятся на отрицательные и положительные. По отношению они делятся на два вида.

1. Физические: относительно роста, веса, внешности, голоса или какой-либо другой части тела.
2. Психологические: комплексы вины, героя, мученика, отличника или отличницы, неполноценности, Эдипов комплекс, нерешительности, власти, Питера Пэна, зависимости от мнения других, превосходства, нелюбви к себе, Наполеона, относительно умственных способностей.

Еще комплексы бывают:

• возрастные – обеспокоенность какими-либо проблемами в определенный отрезок жизни;
• авторские концепции – различные теории психологов, которые основаны на личных критериях;
• социальные – имеются в странах с классовым принципом разделения.

Физические

Все физически слабые места связаны с недовольством этими данными. Соответственно, многие такие комплексы являются положительными, т. к. служат главной причиной улучшения внешних данных и форм. Когда личности не нравится что-либо в своей внешности, то возникает чувство неполноценности, уродства. Очень часто в совокупности с другими мнениями это перерастает в нелюбовь к себе или даже в ненависть.

Комплексы человека по поводу внешности проявляются у подростков и имеют научное название дисморфофобия. Дети в подростковом возрасте очень мнительны и уязвимы, если не побороть эту фобию, то она может остаться на всю жизнь с уже взрослым индивидом.

Симптомы дисморфофобии:

• симптом фотографии – отказ фотографироваться: человек не любит смотреть на собственное отражение в зеркале;
• зеркало – потребность рассматривать в зеркале свои недостатки и находить все время новые;
• желание поговорить об этом – стремление персоны разговаривать о своем недостатке все время и изливать это горе все новым и новым людям;
• отказ от отношений – уверенность личности, что с таким уродом никто не будет дружить, любить и общаться;
• невозможность сосредоточиться на деятельности – происходит при зацикленности на своем недостатке;
• депрессия – она сопровождает и подпитывает любую проблему.

Психологические

Рассмотрим список самых популярных психологических недостатков человека, которые могут вызывать комплексы.

• Комплекс нерешительности – может развиться в любом возрасте вследствие сложности преодоления различных трудностей, препятствий. Обычно это происходит при неудаче в решении проблемы, потому что человек был прерван во время потока мыслей и теперь имеет отсутствие уверенности в своих силах. Такой недостаток имеет такие симптомы: неуверенность в собственных силах, потребность в чужих мнениях, замена решения в окончательный момент, отсутствие самостоятельных решений.
• Комплекс нелюбви к себе – часто человек не признает или скрывает его. Он возникает в результате критики своей внешности, низкой самооценки или уверенности в собственной ущербности. Симптомы: отрицание любви других людей и даже ее возможности, очень низкая самооценка, неимение цели в жизни, полная уверенность, что индивидуум не заслуживает любви к себе.
• Комплекс неполноценности – очень серьезный комплекс, который отравляет жизнь большой части общества. Личность подвержена чувству неполноценности в сравнении с другими людьми или их жизнью. Некоторым людям плохое мнение о себе помогает устанавливать потрясающие результаты, доказывая всем и себе, на что они способны. Остальные заложники таких мыслей замыкаются в своем мире, ведут асоциальный образ жизни, считая, что ничего не могут добиться. Отвращение часто приводит к депрессиям и суициду.

• Зависимость от чужих мнений – возникает при отсутствии уверенности. Похвала помогает таким людям двигаться вперед и чувствовать себя комфортно, а негативное мнение заставит изменить свою позицию. Симптомы у такой зависимости следующие: высокая оценка чужого мнения, огромное влияние публичных мыслей на частную жизнь, негативная реакция на безразличие со стороны общества, невозможность формулировки своего мнения без помощи других. Последствия от этой зависимости могут быть очень ужасными.
• Комплекс вины – проявляется у отчаянных борцов за справедливость. Человек чувствует вину, даже если совершенно непричастен к событиям. И также считает, что все общество создает ему проблемы. Имеются такие симптомы: попытки превзойти возможности человека, лишняя самокритичность, отвращение к себе, страх обидеть кого угодно, чувствительность по отношению мнения других и ложь для предотвращения мнимых опасностей.
• Комплекс отличника/отличницы – попытки совершенства во всех сферах деятельности. Стать лучшим в любом деле становится главной целью. Такие индивидуумы недовольны собой, чувствуют вину, что сделали недостаточно хорошо. При этом недостатке ставится высокая планка во всех сферах жизни, и когда она не достигается, человек испытывает негативные эмоции. Симптомы: подверженность стрессу, повышенная требовательность ко всем людям и действиям, страх ошибки, большая уязвимость от общественного мнения.
• Комплекс Золушки/ Питера Пэна – это синдромы, основанные на неуважении к себе и маленькой вере в собственные силы. Синдром Золушки – боязнь женщины быть независимой от мужчин и острая потребность в психологической защите. Синдром Питера Пэна – это нежелание мужчины взрослеть и брать на себя ответственность за свои слова и поступки, неспособность самостоятельно решать проблемы и совершать некоторые действия. Такие мужчины отличаются ленивым поведением и желанием иметь все, не прилагая никаких усилий.
• Комплекс превосходства – это мнение человека, что он превосходит остальных в чем-либо. Очень часто такие личности поучают других, дают им ненужные или непрошенные советы. Нередко этот комплекс является замаскированным комплексом неполноценности и за унижением других людей индивидуум пытается доказать себе свою крутость и повысить собственное достоинство. Такие люди могут отравлять жизнь другим своими советами и потом огорчаются, что окружающие не захотели иметь с ними дело.
• Эдипов комплекс – довольно сложное заболевание, основанное на сексуальном влечении парня к матери или девушки к отцу. Практически всегда такое влечение является неосознанным.

Способы борьбы

Когда у человека отсутствуют комплексы или они незначительно влияют на психологическое состояние, то личность:

• имеет объективную самооценку;
• ожидает позитивного отношения от других людей и от всего внешнего мира;
• положительно воспринимает свою личность в окружающей среде.

Комплексы мешают полноценной жизни, в большинстве случаев от них необходимо избавляться и неважно — физические они или психологические.

В первую очередь, необходимо признать проблему. Это уже половина ее решения, многие люди не признают наличие у себя того или иного комплекса или очень тщательно скрывают их даже от близких людей.

Очень важно уметь любить себя. Когда человек находит в себе положительные качества и достоинства своей внешности, то он начинает немного любить себя. Еще можно недостатки превратить в индивидуальные особенности своего характера, что тоже положительно влияет на самооценку.

Можно замаскировать некрасивые, по личному мнению, части тела или интересно выделить их. В основном это касается внешности: человек может создать эксперименты с образами, проявить фантазию и добавить нечто очень интересное в свой внешний вид. Основной уход за собой, красивая и подходящая одежда и макияж делают женщину действительно привлекательной, поднимают ее самооценку и увеличивают любовь к себе.

Следует объективно оценивать свою личность и постараться определить, что является недостатками, а что — преимуществами.

А также не стоит думать, что если ты не идеален, то нет необходимости ухаживать за собой. Иногда человек с интересной внешностью обладает большей популярностью, чем заурядные мужчина или женщина.

Большим заблуждением будет уход только за внешностью. Кроме физических данных, каждый человек имеет природное обаяние, очарование, загадку и интеллект. Эти данные важны не меньше красивой одежды и модной стрижки.

Заключение

Все комплексы находятся у нас в голове, необходимо проанализировать и побороть их. Профессиональную помощь в борьбе с собственными страхами предоставляют сеансы психолога, а для закрепления результата можно прочитать различную научную литературу по этой теме.

Важными в такой борьбе со своими недостатками являются вера в себя и активные действия. Необходимо двигаться сквозь все препятствия и бороться со страхами.

Царская Усадьба — бани и сауны, оздоровительно-банный комплекс в Ульяновске

Отдыхайте с Усадьбой!

«Усадьба» с радостью приглашает жителей и гостей города посетить наши бани и сауны в Ульяновске! 

  

Русские бани, финские и турецкие сауны знамениты на весь мир своей пользой. Это не только способы очищения тела, но и неотъемлемые элементы культуры. В суете современного мира, в условиях загазованности окружающей среды, так важно иногда сделать паузу в высоком темпе жизни и позволить отдохнуть душе и телу. Баня и сауна прекрасный способ позаботиться о своем здоровье, снять стресс, провести время в компании семьи и друзей. Банный комплекс «Усадьба» находится в черте города Ульяновск, что делает это место доступным для отдыха в любые выходные и среди недели, а так же это особенно удобно для тех, кто регулярно посещает баню и она является неотъемлемой частью образа жизни. 

Отдых в Усадьбе покажется Вам настоящим райским местечком, где можно отдохнуть с друзьями после долгой рабочей недельки, организовать семейный отдых, провести мальчишник и девичник. Проведите время в банях и саунах Усадьбы, и почувствуете, как жизненные силы переполняют Вас, кожа на всем теле станет подтянутой, и Вы с уверенностью скажите: «Я как заново родился!»

Проводите свои праздники в нами! В Ульяновске наши бани и сауны замечательно подойдут для празднования любого мероприятия, начиная от больших компаний во время корпоративного отдыха, групп друзей на девичниках и мальчишниках и заканчивая организацией семейных праздников и романтических вечеров для двоих. Вас порадует высокий уровень сервиса, а наши профессиональные работники с удовольствием исполнят любые особенности заказа и ваши пожелания.

Уникальный подход к любому клиенту!

Наши бани и сауны в Ульяновске удовлетворят вкусы как специалистов и профессиональных ценителей парного дела, так и желающих впервые посетить процедуру оздоровления и очищения посредством пара. Нигде в городе вы не найдете такого комплексного обслуживания в области отдыха и оздоровительных услуг. На выбор нашим гостям, банный комплекс «Усадьба» предлагает посетить:

• Русскую баню – традиционный элемент русской культуры и старинный обычай близкий душе каждого русского человека. «Усадьба» приглашает вас очистить свое тело в дух в русской бане из липы. Основные элементы такой бани высокая влажность, жар и ароматный пар пропитанный запахом целебных трав. Ну и конечно же, какая русская баня без традиционного массажа березовым или дубовым веником? А затем можно закалиться, облившись холодной водой из катки или окунувшись в бассейн. Отличным завершением банных процедур будет чашечка вкусного чая в уютной гостиной.
• Деревенская баня на дровах – это поистине уникальный формат отдыха! В вашем распоряжении будет небольшая усадьба с маленьким двориком и бассейном на открытом воздухе. Домик, выполненный полностью в стиле русской народной избы, создаст особенно уютную атмосферу для вашей компании.
• Турецкую сауну или Хаммам – великолепная возможность расслабиться и повысить здоровье своего тела. Особенностью такой бани является высокая влажность, при том, что температура пара значительно ниже, чем в русской бане. Турецкая баня отличный способ позаботиться о своей коже: провести процедуру пилинга и специального массажа. Посещая турецкую сауну «Усадьбы» вы получите настоящее эстетическое удовольствие, отдыхая в окружении полов и стен из мраморной плитки декорированных мозаичными панно.
• Финскую сауну — Обновленная сауна, с роскошной гостиной, теплым бассейном и жаркой парной. А водяная горка спускающаяся в бассейн запомнится вашим детям надолго.
• Скандинавскую баню — Бассейн с морской солью, атмосферная комната отдыха и жаркая парная. «Фишка» этого номера парная с выходом в бассейн, а барбекю в гостиной позволит вам самостоятельно приготовить мясо на углях даже в плохую погоду.
• Японскую баню — Уютная баня в духе японской «Фурако» Две бочки с холодной и горячей водой. А теперь еще  небольшой и не глубокий бассейн — идеально подойдет для отдыха с детьми. А пока дети купаются, родители смогут сыграть в «Русский бильярд»

Цитогенетический статус человека и эффективность применения мультивитаминных комплексов

¹ Буробина А.В., ² Сычева Л.П., ³ Труханов А.И., ¹ Жученко Н.А., ¹ Асанов А.Ю.

¹ Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), Москва, Россия
² Государственный научный центр Российской Федерации – Федеральный медицинский биофизический центр имени А.И. Бурназяна Федерального медико-биологического агентства России, Москва, Россия
³ Группа компании АСВОМЕД, Москва, Россия

Резюме:

Механизм действия многих мутагенов является прооксидантным, в качестве антимутагенов стали изучать витамины, обладающие антиоксидантным действием, например, витамины А и С. Основным методом оценки цитогенетического статуса человека является анализ частоты хромосомных аберраций в лимфоцитах крови. Однако, в качествеальтернативы для оценки хромосомных повреждений все чаще применяют неинвазивный (без взятия крови) микроядерный метод на эпителиальных клетках слизистой щеки. В данной работе проведено изучение влияния приемарекомендуемых профилактических доз препарата “Helvesana”, обладающего антиоксидантными и адаптогеннымисвойствами, на здоровье человека по показателям цитогенетического статуса и клеточной кинетики соматическихклеток (буккальных эпителиоцитах). В качестве одного из механизмов индукции мутаций в клетках организма рассматривается внутриклеточное образование свободных радикалов под воздействием химических, физических илибиологических факторов. Исследование проведено с использованием инновационного неинвазивного полиорганного кариологичнского теста ПКТ, позволяющего учитывать широкий спектр цитогенетических показателей, показателей пролиферации и деструкции ядра клеток. При сравнении кариологических показателей буккального эпителиядоноров до и после приема препарата “Helvesana” отмечена тенденция к снижению частоты клеток с цитогенетическими нарушениями, показателей пролиферации и нормализация состояния буккального эпителия по показателямдеструкции ядра. Статистически достоверные отличия выявлены по доле клеток с перинуклеарной вакуолью, кариорексису и полному кариолизису. Для большей части участников обследования после приема препарата“Helvesana”отмечено улучшение цитогенетического статуса. В рамках новой парадигмы профилактики заболеваний, основаннойна персонифицированном предотвращении повреждений ДНК, на повестке дня стоит вопрос о внедрении микроядерного теста для оценки эффективности и безопасности применения природных и синтетических антимутагенов.

Ключевые слова: Мутагены, витамины, хромосомные аберрации, антиоксиданты, адаптогены, цитогенетический статус, буккальные эпителиоциты, кариологический тест, перинуклеарная вакуоль, кариорексис, кариолизис, свободные радикалы, микроядерный тест, генетический статус.

Список литературы:

1. Бочков Н.П., Катосова Л.Д. Генетический мониторинг популяций человека при реальных химических и радиационных нагрузках / /Вестник РАМН.- 1992.- №4.- С.10-14.
2. Дружинин В.Г. Хромосомные нарушения у населения крупного промышленного региона: пространственно-временной цитогенетический мониторинг //Автореф.дисс. д.б.н. — М.-2003. — 44 с.
3. Дурнев А.Д. Генетическая токсикология // Вестник РАМН.-2011.-№9.-С.35-43.
4. Дурнев А.Д. Методологические аспекты исследований по модификации химического мутагенеза // Бюлл. экспериментальной биологии и медицины .-2008.-Т.146.-№9.- С.281-287.
5. Дурнев А.Д. Модификация мутагенного процесса в клетках человека // Вестник РАМН.-2001.-№10.-С.70-76.
6. Дурнев А.Д., Серединин С.Б. Мутагены: скрининг и фармакологическая профилактика воздействия. М.-1998.- 160 с.
7. Зайцева И.П. Влияние обогащения рационов питания витамино-минеральным комплексом в сочетании с адаптогенами на обеспеченность железом, медью и марганцем и иммунную реактивность у студентов-спортсменов//Вестник восстановительной медицины. — 2013.- №6(58). — С.80-83.
8. Мазо В.К., Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Пенева В.В. Микронутриенты-антиоксиданты в составе обогащенных и функциональных пищевых продуктов//Вестник восстановительной медицины. — 2013.- №2(54). — С. 55-58.
9. Аксенова В.И., Шарипова М.М., Извольская М.С., Воронова С.Н., Василенко А.М. Влияние фитопрепаратов на гуморальный иммунный ответ// Вестник восстановительной медицины. — 2012.- №6(52). — С. 19-21.
10. Герцик Ю.Г., Буравкова Л.Б. О необходимости анализа иммунологических и генетических факторов, влияющих на эффективность медицинской реабилитации//Вестник восстановительной медицины. — 2014.- №2(60). — С. 17-20.
11. Колесов С.А., Блинова Т.В., Рахманов Р.С., Страхова Л.А., Умнягина И.А., Хайров Р.Ш. Особенности витаминно-минеральной насыщенности организма хоккеистов высшей квалификации в соревновательный период их спортивной деятельности//Спортивная медицина: наука и практика. — 2018.- Т8,№18. — С.59-64.
12. Воронков А.В., Поздняков Д.И., Руковицина В.М., Оганесян Э.Т. Некоторые аспекты безопасности и фармакологической эффективности (влияние на мышечную дисфункцию) новых производных хромон-3-альдегида // Спортивная медицина: наука и практика. — 2018. — Т8,№3. — С.65-71.
13. Балыкова Л.А., Ивянский С.А., Пиксайкина О.А., Ефимова Ю.А. Обоснование использования l-карнитина в спортивной медицине//Спортивная медицина: наука и практика. — 2011.-№1. — С.26-34.
14. Методические рекомендации «Оценка цитологического и цитогенетического статуса слизистых оболочек полости носа и рта у человека» (Беляева Н.Н., Сычева Л.П., Журков В.С. и др.). 2005.- М.- 37 с.
15. Оценка цитологического и цитогенетического статуса слизистых оболочек полости носа и рта у человека. Методические рекомендации. Утверждены Председателем НС РАМН и МЗ и СР России по экологии человека и гигиене окружающей среды. М., 2005
16. Полиорганный микроядерный тест в эколого-гигиенических исследованиях. (Под редакцией академика РАМН Ю.А.Рахманина и д.б.н. Л.П.Сычевой). // М.: Гениус, 2007. -312 с.
17. «Способ неинвазивной диагностики цитогенетического и цитотоксического действия факторов окружающей среды на организм человека». Изобретение №2292027, зарегистрировано в Государственном реестре изобретений РФ 20 января 2007 по заявке №2005108225.
18. Сычева Л.П. Биологическое значение, критерии определения и пределы варьирования полного спектра кариологических показателей при оценке цитогенетического статуса человека.// Медицинская генетика.-2007.-№11.-С.3-11.
19. Юрченко В.В., Подольная М.А., Ингель Ф.И. и др. Микроядерный метод на клетках буккального эпителия.//В кн. Полиорганный микроядерный тест в эколого-гигиенических исследованиях. Под ред. Ю.А. Рахманина и Л.П. Сычевой. — М. Гениус.- 2007.- С.220-268.
20. Юрченко В.В., Сычева Л.П., Ревазова Ю.А., Ревич Б.А., Журков В.С. Анализ частоты микроядер и ядерных аномалий в эпителиальных клетках слизистой щеки у женщин, контактирующих с диоксинами. // Токсикологический вестник.-2000.- №3 — C.2-6.
21. Aardema M.J., Albertini S., Arni P. et al. Aneuploidy: a report of an ECETOC task force.// Mutat Res.- 1998.-V.410, N1.-P.3-79.
22. Andreassi M.G., Barale R., Iozzo P., Picanj E. The association of micronucleus frequency with objesity, diabetes and cardiovascular disease. // Mutagenesis.-2011.-V.26, N1.-P.77-83.
23. Bonassi S., El-Zein R., Bolognesi C., M.Fenech. Micronuclei frequency in peripheral blood lymphocytes and cancer risk: evidence from human studies.// Mutagenesis.-V.26,N1/-P.93-100.
24. Bonassi S., L. Hagmar, U. Stromberg, A.H. Montagud, H. Tinnerberg, A. Forni, P.Heikkila, S. Wanders, P. Wilhardt, I.L. Hansteen, L.E. Knudsen, H. Norppa. Chromosomal aberrations in lymphocytes predict human cancer independently of exposure to carcinogens. European Study Group on Cytogenetic Biomarkers and Health.// Cancer Res.- 2000.-V.60.- P.1619-1625.
25. Fenech M. The Genome Health Clinic and Genome Health Nutrigenomics concepts: diagnosis and nutritional treatment of genome and epigenome damage on an individual basis.// Mutagenesis.-2005-V.20, N4.-P.255-269.
26. Fenech M., Holland N., Zeiger E. et al. The HUMN and HUMNxL international collaboration projects on human micronucleus assays in lymphocytes and buccal cells — past, present and future.//Mutagenesis.-2011.-V.26, N.1.-P.239-245.
27. Holland N., Bolognesi C., Kirsch-Volders M. et al. The micronucleus assay in human buccal cells as a tool for biomonitoring DNA damage: The HUMN project perspective on current status and knowledge gaps.//Mutation Res.-2008.-V.659.-N1-2.-P.93-108.
28. Lal A., Ames B. Association of chromosome damage detected as micronuclei with hematological diseases and micronutrient status.//Mutagenesis.-V.26, N1.-P.
29. Migliore L., Coppede F., Fenech M, Thomas P. Association of micronucleus frequency with neurodegenerative diseases. //Mutagenesis.-V.26., N1.-P.85-92.
30. Thomas P., Holland N., Bolognesi C., Kirsch-Volders M., Bonassi S., Zeiger E., Knasmueller S., Fenech M. Buccal micronucleus cytome assay// Nat. Protoc. 2009.- V.4.-P.825-837.
31. Tolbert P.E., Shy C.M., Allen J.W. Micronuclei and other nuclear anomalies in buccal smears: methods development. //Mutat Res.- 1992.-V.271, N1.-P.69-77.
32. Труханов А.И., Скакун С.Г., Гречко А.В. Современная роль персонифицированной цифровой медицины в развитии медицинской реабилита-ции//Вестник восстановительной медицины. — 2018.- №1(83). — С.2-13.

Дом у моря — База отдыха на Финском заливе в Ленинградской области

Добро пожаловать на официальный сайт загородного клуба и базы отдыха в Ленинградской области «Дом у моря». Название нашего курорта говорит само за себя — мы предоставляем в аренду коттеджи и домики на берегу Финского залива, где можно комфортно отдохнуть как с друзьями, так и с семьей.

Курорт «Дом у Моря» — это загородный клуб на берегу Финского залива в Выборгском районе Ленинградской области, который включает в себя разнообразные объекты для отдыха:виллы с видом на пляж Финского залива, отдельные домики в лесу,загородный отель, а так же ресторан «МореШаль». На базе отдыха постоянно проходят различные мероприятия для развлечения гостей — мастер-классы, живая музыка в ресторане, анимация для детей. У нас есть все как для активного, так и спокойного расслабленного отдыха.

Наш курорт идеально подходит для семейного отдыха с маленькими детьми. На территории курорте есть детские площадки, различные детские игровые наборы, игровая комната, проходят детские мастер-классы. Для вашего удобства на курорте работает няня.

У нас Вы можете снять коттедж с сауной или без, или даже двухэтажную виллу с видом на залив для полноценного семейного отдыха в Выборгском районе Ленинградской области.

Наш клуб не позиционируется как зимняя или летняя база отдыха — мы ждем гостей круглый год! Удобное расположение клуба загородного отдыха рядом с Санкт-Петербургом позволяет нашим гостям в любое время вырваться из городской суеты. Курорт расположен в Карельском лесу — большая территория, сосны и чистый воздух, помогут Вам отдохнуть от городской духоты в прекрасном месте рядом с Санкт-Петербургом, в Выборгском районе Ленинградской области.

На загородной базе отдыха мы предоставляем в аренду посуточно домики и коттеджи с баней, которые расположены уединенно друг от друга в сосновом лесу — так, чтобы Вашему отдыху никто не помешал. Кроме того, на территории находится банный комплекс вместимостью до 10 человек.

На нашем официальном сайте доступны как посуточная, так и длительная аренда коттеджей, загородных домов и номеров отеля на базе отдыха, а так же аренда с питанием (полный пансион) для лучшего загородного отдыха.

База отдыха «Дом у Моря» задумана как идеальное место для загородного отдыха с детьми, отдыха во время детских каникул на природе летом и зимой. Здесь можно арендовать дом и провести свадьбу, день рождения или другой праздник, даже Новый Год — или просто выходные.

Вы можете снять отдельный домик у моря на коттеджной базе отдыха или номер в отеле на нашем официальном сайте. Домики в лесу и номера сдаются в аренду посуточно. Перейдите по ссылке, чтобы узнать подробнее о ценах аренды коттеджей на базе отдыха и вариантах размещения.

Места на базе отдыха и коттеджи ограничены, поэтому мы просим Вас планировать свой приезд заранее через наш официальный сайт или по контактному телефону.

Архивы человеческих комплексов — Человеческий интеллект

Комплексы превосходства основаны на превосходном функциональном интеллекте, подразумевающем иное структурное отношение. Их чувство превосходства трансформируется в комплекс, когда они начинают использовать свой превосходный функциональный интеллект в областях, которыми нельзя управлять с помощью такого подхода. Но им нужно поддерживать свои превосходящие силы, чтобы попытаться это сделать. Результат подразумевает обвинение окружающей среды в парадоксальных результатах.

В то время как комплекс неполноценности ведет к бездействию, чтобы отрицать реальность, влияющую на самооценку, комплексы превосходства стремятся к агрессивным активным действиям, чтобы уничтожить беспокоящий объект.

Комплексы превосходства подразумеваются в решениях, принимаемых антиинтуицией в пугающей среде, использующей анти-интеллект для уничтожения объекта, который угрожает самовосприятию превосходства.

Чрезвычайно талантливые люди развивают этот комплекс, живя в посредственной среде. Посредственная среда — это среда, в которой нет уважения и восхищения по отношению к членам группы, обладающим способностью повышать ценность.

Когда отношения с властью не включают уважения и восхищения, талантливые люди становятся маргиналами.«Ботаны» — это некоторые из имен, которые унижают талант человека и превращают фактическое превосходство в личный комплекс.

С другой стороны, талантливые люди, которые считают, что их навыки не имеют социальной ценности, развивают комплекс неполноценности, если их отвергают в обществе.

Во избежание разрушения они становятся агрессивными по отношению к окружающей среде. Агрессия может быть активной, если их комплекс не интегрирован с комплексом неполноценности, или пассивной, если они ощущают неполноценность, имея дело с другими областями, кроме той (или нескольких), в которой они талантливы.

Характеристика комплекса превосходства

1. Основано на физическом преимуществе
2. Это влияет на все виды деятельности человека
3. Он создает личную вымышленную среду для решения проблем, используя чрезмерно упрощающие аналогичные подходы, основанные на их конкретном таланте.
4. Нацелен на будущее, чтобы избежать ответственности за текущие действия
5. Он использует всемогущество в качестве водителя, чтобы избежать чувства неполноценности
6. Вызывает эгоистичное, завистливое и жадное поведение
7. Он производит дуалистический, антагонистический, аналогичный подход к реальности
8. Ищет решение исключительно в будущем
9. Он вызывает навязчивое отношение брать, а не отдавать
10. Вызывает искажение восприятия угрожающего аспекта реальности

Основное отличие состоит в том, что Комплекс превосходства побуждает людей играть активную роль в окружающей среде.Таким образом, они обычно проявляют агрессию, используя как активную агрессию, так и / или пассивное сопротивление как способ атаки на окружающую среду.

Они не работают в командах. Они «индивидуальные предприниматели».

Петр Белохлавек

ПРИМЕЧАНИЕ. Исследовательский институт Unicist был пионером в использовании логического подхода unicist в исследованиях науки о сложности и стал частной глобальной децентрализованной ведущей исследовательской организацией в области адаптивных систем человека. У него есть академическая и деловая ветви.https://www.unicist.org/turi.pdf

человеческих комплексов и их лечение

ПОКАЗЫВАЕТ 1-10 ИЗ 45 ССЫЛОК

СОРТИРОВАТЬ ПО РелевантностиСамые популярные статьиНедавно

Законы эмоций.

• Н. Фрейда
• Медицина, Психология
• Американский психолог
• 1988

Утверждается, что эмоции являются законными явлениями и, таким образом, могут быть описаны с помощью набора законов эмоций. Эти законы являются результатом действия механизмов эмоций, доступных для… Развернуть

Толпа из одного человека: будущее индивидуальной идентичности

Этот свежий и провокационный взгляд на то, как технологии влияют на бизнес и общество, представляет собой видение нового научного понимания человеческая природа и личность.Джон Клиппингер — ведущий… Развернуть

Карл Густав Юнг: биография

В начале карьеры Юнга он был поклонником и протеже Зигмунда Фрейда, приемного «сына» «отца» Фрейда; затем, после их знаменитой ссоры, он стал его соперником и заклятым врагом. Спорный… Развернуть

• Просмотреть 2 отрывка, справочная информация

Введение в теории личности

ФОКУС НА ПСИХОДИНАМИЧЕСКИЕ СИЛЫ. Классический психоанализ: Зигмунд Фрейд.Современная психоаналитическая теория: Эрик Эриксон и другие. Аналитическая психология Карла Юнга. Межличностная динамика:… Развернуть

• Просмотреть 4 выдержки, справочная информация

Цель образования

Здесь сделана попытка применить результаты недавних психологических исследований для решения образовательных трудностей, и книгу можно рекомендовать рядовым читателям интересуется образованием, но не знаком с психологией. Развернуть

Теория психоанализа

Новая книга enPDFd теория психоанализа для чтения, где некоторые книги полностью читаются за неделю и требуется обязательство поддерживать чтение.Развернуть

• Просмотреть 1 отрывок, справочная информация

Социальная психология межгрупповых отношений

ИНДИВИДУАЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ В ПОВЕДЕНИИ МЕЖДУ ГРУППЫ 3 От индивидуального к групповому впечатлению 3 ЧЛЕНСТВО В ГРУППЕ И ПОВЕДЕНИЕ В ГРУППЕ 7 Масштабы и диапазон развития этноцентризма 8 Теизм

Корпоративная социальная ответственность

В контексте некоторой критики образования в области социальной ответственности в бизнес-школах в статье приводятся результаты обзора образования в области КСО (преподавание и исследования) в Европе.Он анализирует… Развернуть

Характеристики мембран настраивают активность эндосомных и аутофагических комплексов VPS34 человека

В этом исследовании мы систематически исследовали важность трех физико-химических параметров мембраны на активность липидкиназы, структуру и динамику комплексов I и II VPS34. Мы обнаружили, что все три параметра, дефекты упаковки, вызванные ненасыщенностью ацильной цепи как для субстратных, так и для не субстратных липидов, кривизна мембраны и электростатика, существенно влияют на активность обоих комплексов.Было удивительно, что изменение состояния насыщения только одной из двух ацильных цепей резко изменило активность обоих комплексов. Вариации в составе ацильных цепей глицерофосфолипидов могут привести к появлению тысяч видов липидов. Тем не менее, клетки млекопитающих обладают некоторыми отличными паттернами обогащения ацильных цепей. Одним из ярких примеров этого является то, что 40–85% PI присутствует в виде SAPI (18: 0/20: 4) (Barneda et al., 2019; Blunsom and Cockcroft, 2020; Bozelli and Epand, 2019). Мы показали, что киназа VPS34 активируется ненасыщенностью своего субстрата PI (рис. 3B).Это согласуется с наблюдением C. elegans , что истощение фермента, который включает полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) в позиции sn-2 PI, значительно снижает содержание PI (3) P и размер ранних эндосом без снижение общего ИП (Lee et al., 2008; Lee et al., 2012). Более удивительным оказался наш результат: увеличение ненасыщенности фоновых липидов также резко увеличило активность комплексов I и II (рис. 2). Эффект фоновой ненасыщенности липидов, вероятно, в значительной степени опосредован адаптерным плечом, поскольку VPS34 сам по себе не проявляет активности в отношении липидов на основе DO (10% PS) (рис. 4C), тогда как комплексы I и II в той же липидной смеси активны ( Рисунок 4D и E).Активность стеароил-КоА-десатуразы важна на ранних этапах аутофагии (Ogasawara et al., 2014; Köhler et al., 2009), и недавние липидомные анализы показали, что аутофагические мембраны почкующихся дрожжей содержат до 60% липидов с двумя ненасыщенными жирные ацильные группы и только 2% без двойных связей (Schütter et al., 2020). Сильный эффект ненасыщенности липидов на комплексы VPS34 в сочетании с компартмент-специфической ненасыщенностью липидов предполагает важное средство модуляции активности VPS34 на клеточных органеллах.Важность ненасыщенности липидов для активности VPS34 аналогична тому, что сообщалось для другой липидной киназы, участвующей в образовании полифосфоинозитидов. Увеличение ненасыщенности ацильной цепи для субстратных и не субстратных липидов в мицеллах детергента активирует изоформы фосфатидилинозитол-4-фосфат-5-киназы (Shulga et al., 2012).

Комплексы VPS34 человека активируются за счет увеличения кривизны мембраны (рис. 2), что согласуется с результатами для дрожжевых комплексов I и II (Ростиславлева и др., 2015) и человеческих комплексов I и II (Brier et al., 2019). Альтернативная возможность, которую нельзя исключить, состоит в том, что более мелкие GUV включают больше ненасыщенных липидов во время своего образования и, следовательно, способны более эффективно привлекать два комплекса. Кривизна мембраны вызывает наклон липидов и снижение упаковки липидов, тем самым открывая гидрофобные полости, которые могут быть обнаружены белковыми мотивами, такими как мотив ALPS из комплекса I (Vanni et al., 2014), и мотивами из домена BARA обоих комплексов I и II.Хотя комплексы VPS34 осуществляют белок / белковые взаимодействия, которые помогают локализовать их в определенных липидных компартментах, предпочтение высокой кривизны и ненасыщенности липидов может способствовать отсутствию активности этих комплексов PI3K в PM, который обогащен насыщенными липидами и имеет нижняя кривизна (Bigay, Antonny, 2012). Rab5 является основным детерминантом для рекрутирования комплекса II в ранние эндосомы. Интересно, что, как и комплекс II, Rab5 предпочитает мембраны-мишени с высокой кривизной и мононенасыщенными липидами, и это предпочтение происходит из-за того, что ненасыщенные пренильные липиды, прикрепленные к Rab5, подходят к дефектам упаковки в мембране-мишени (Kulakowski et al., 2018). Кривизна и упаковка липидов тесно связаны, следовательно, потере активности VPS34, вызванной плотной липидной упаковкой насыщенных липидов, можно противодействовать увеличением кривизны мембраны (Рисунок 2).

В качестве третьего физико-химического параметра мы протестировали влияние электростатики на активность комплексов VPS34 путем увеличения концентрации фосфатидилсерина (ФС). PS обогащается на цитозольной створке плазматической мембраны (PM) и эндоцитарных пузырьках, главным образом, в рециклирующих эндосомах (RE) (Fairn et al., 2011). PS на цитозольной створке играет важную роль в регуляции путей эндоцитоза (Uchida et al., 2011). Мы обнаружили, что PS активирует комплексы I и II, а также только VPS34 (рис. 4C – E). Примечательно, что GUV с 25% PS позволили комплексу II достичь такой же активности, что и комплекс I (рис. 4G), тогда как на мембранах с 10% PS комплекс I был намного активнее, чем комплекс II (рис. 4F). Способность высокого содержания PS сильно активировать комплекс II может способствовать активности комплекса II на ранних эндосомах, которые имеют больше PS, чем ER (Hullin-Matsuda et al., 2014). Разумно предположить, что PS вместе с Rab5 может вносить вклад в активацию комплекса II на ранних эндосомах. Повышенный PS в сочетании с высокой кривизной и неплотно упакованными липидами также может способствовать активации комплекса I во время аутофагии. В клетках PS синтезируется с помощью PS-синтаз (PSS) I и II на мембранах, ассоциированных с митохондриями ER (MAM) (Lagace and Ridgway, 2013). При голодании комплекс I рекрутируется в МАМ (Hamasaki et al., 2013). PSS I совместно локализуется с FIP200, членом комплекса инициации аутофагии, который необходим для рекрутирования комплекса I (Nishimura et al., 2017). Мембраны ER обогащены неплотно упакованными липидами, а место инициации фагофора представляет собой сильно изогнутую структуру, известную как омегасома (Ax et al., 2008). Это д. Обеспечить идеальную платформу для активации комплекса I. Однако свойства мембраны сами по себе не могут объяснить склонность комплекса I обеспечивать активность PI3K при аутофагии по сравнению с комплексом II. Дополнительные взаимодействия могут способствовать обогащению комплекса I на аутофагосомах. Недавно было показано, что BATS-домен ATG14L может действовать как детектор совпадений, используя свой мотив ALPS для взаимодействия с мембранами, а его мотив LIR — для взаимодействия с аутофагическими GAPARAP (Birgisdottir et al., 2019). Наряду с комплексом ULK1 они могут вносить вклад в специфическую для аутофагосом локализацию и активацию.

Как результаты HDX-MS, так и мутационные анализы предполагают, что комплексы I и II обладают некоторыми комплексно-специфическими, а также общими взаимодействиями с мембранами. На GUV, изготовленных с использованием основных липидов DO, комплекс I человека значительно более активен, чем комплекс II, что контрастирует с нашими результатами для дрожжевых комплексов VPS34, где комплекс II был более активен, чем комплекс I (Ростиславлева и др., 2015). Противоположное поведение комплексов VPS34 человека и дрожжей, вероятно, возникает из-за значительных различий в последовательностях между Atg14 человека и дрожжей, особенно в области, соответствующей C-концевому BATS ATG14L. Взаимодействие BATS-домена комплекса I с мембранами является наиболее ярким из комплексно-специфических мембранных взаимодействий в комплексах VPS34 человека. BATS доминирует в мембранном взаимодействии комплекса I. Когда домен BATS удаляется, почти вся активность комплекса I устраняется (рисунок 7).Более того, комплекс I связывается с мембранами сильнее, чем комплекс II (Figure 1D and Ma et al., 2017). Добавление домена BATS либо к полноразмерному UVRAG, либо к фрагменту UVRAG, лишенному C-конца, резко увеличивает активность комплекса II (рис. 7D) и связывание с мембраной in vitro и в клетках (Ma et al., 2017). Наши результаты предполагают, что различия в активности комплексов I и II отражают более низкое сродство комплекса II к липидным пузырькам (рис. 1C и D). В клетках это слабое сродство к мембране комплекса II может компенсироваться его партнерами по связыванию, такими как Rab5, которые помогают рекрутировать комплекс II на мембраны (Christoforidis et al., 1999). Наши результаты также показывают, что активности комплексов I и II выравниваются на липидных везикулах с повышенным PS, и это согласуется с предыдущим отчетом о том, что комплексы I и II имеют идентичную активность на LUV, образованных с 50% PS и 50% PI (Brier и др., 2019).

К нашему удивлению, мутант с делецией ALPS показал даже более низкую активность, чем только VPS34 (рис. 7C), что позволяет предположить, что влияние субъединицы ATG14L является внутренне ингибирующим, но это ингибирование преодолевается гораздо более сильным мембранным связыванием, обеспечиваемым доменом BATS. , что приводит к общему увеличению функциональности.О подобном механизме сообщалось для комплекса H-Ras-PI3Kα, где связывание H-Ras ингибирует PI3Kα, но ингибирование преодолевается за счет увеличения рекрутирования PI3Kα на мембраны (Buckles et al., 2017). Присутствие субъединицы ATG14L изменяет взаимодействия остальной части комплекса с мембранами. Эта субъединица, по-видимому, усиливает ассоциацию домена киназы VPS34 с мембранами (вызывая защиту области kα1-kα2 VPS34; фиг. 5). Он также изменяет взаимодействие Beclin 1 с мембранами, так что хотя мотив AF1 домена BARA играет роль в связывании с мембраной обоих комплексов, мотивы AF2 и HL важны только для комплекса II (рис. 5, 6 и 8).Однако в контексте доминирующей роли домена BATS в активности комплекса I влияние Beclin 1 AF1 на активность незначительно, и нет значительного влияния AF2 или HL (Рисунок 8). Это согласуется с предыдущим сообщением о том, что мутация AF1 лишь незначительно влияет на поколение аутофагосом (Huang et al., 2012). Возможно, домен BATS влияет на ориентацию комплекса I, так что AF2 и HL больше не взаимодействуют с мембранами. В отличие от комплекса I, комплекс II критически зависит от AF1, AF2 и HL, чтобы обеспечить его максимальную активность на мембранах (рис. 8).Активность дрожжевого комплекса II также зависит от AF1 (Ростиславлева и др., 2015), что указывает на сходство механизмов активации этих двух ортологичных комплексов. Мотив HL в домене BARA (фиг. 6 и 8) содержит S295, который может фосфорилироваться с помощью Akt (Wang et al., 2012), что усиливает взаимодействия Beclin 1 с 14-3-3 и белками промежуточных филаментов виментина. С другой стороны, мутация S295A усиливает аутофагию (Wang et al., 2012). В клетках фосфорилирование S295 с помощью Akt и / или взаимодействие с 14-3-3 может отрицательно влиять на связывание с мембраной комплексов I и II.

В дополнение к мотиву AF1 в BARA-домене Beclin 1, другой областью, демонстрирующей снижение HDX в обоих комплексах I и II, является линкер CC2 / BARA Beclin 1 (остатки 262–274 в комплексе I и остатки 262–270 в комплексе II ). Было высказано предположение, что гидрофобные остатки Phe270 и Phe274 в этом линкере взаимодействуют с липидными мембранами (Chang et al., 2019). В соответствии с этим мутация Phe270 и Phe274 устраняет связывание с мембраной и активность комплекса II (Chang et al., 2019). Несколько удаленное положение этих двух остатков от предполагаемой мембранно-связывающей поверхности, маркированной AF1, побудило предположить, что соседние цепи BARA β1 и β2 становятся незафиксированными, чтобы позволить Phe270 / Phe274 достичь мембраны.Хотя эти два гидрофобных остатка были защищены от HDX в присутствии липидных мембран в наших исследованиях (рисунки 5 и 6), пептиды, покрывающие β1-β2 β-слоя 1 домена BARA (остатки 275–287, 276–294, Дополнительные файлы 4 и 5) не показали значительных изменений HDX. Кроме того, у дрожжей мембраны вызывают увеличение HDX в этой области (остатки 312–327 в Vps30) (Ростиславлева и др., 2015). Следовательно, вопрос о том, становится ли линкер CC2 / BARA более защищенным за счет прямого взаимодействия с мембранами или из-за косвенного упорядочения в присутствии мембран, остается открытым вопросом.

Оба комплекса I и II активируются PI (4) P. Этот фосфоинозитид обогащен аппаратом Гольджи (Hammond and Balla, 2015), ранними эндосомами (Henmi et al., 2016) и аутофагосомами (Judith et al., 2019; Wang et al., 2015), где активируются комплексы I и II. Совпадение Rab5, PS и PI (4) P на ранних эндосомах может способствовать специфическому усилению активности комплекса II в этом компартменте. (Judith et al., 2019; Munson et al., 2015; Sridhar et al., 2013; Wang et al., 2015) Мы также обнаружили, что PI (4,5) P ₂ умеренно увеличивает активность комплекса I ( Рисунок 9E).Это может быть опосредовано связыванием PI (4,5) P ₂ с доменом ATG14L BATS (Wang et al., 2015; Tan et al., 2016). Интересно, что недавно было показано, что PIPKIγi5, который фосфорилирует PI (4) P с образованием PI (4,5) P ₂ , связывается с ATG14L и локализуется в аутофагосомах (Tan et al., 2016). По сравнению с эффектами трех физико-химических параметров мембраны, фосфоинозитиды PI (4) P и PI (4,5) P ₂ имеют лишь умеренные эффекты in vitro .

В целом, наши результаты выявили важность упаковки липидов, продиктованной ненасыщенностью ацильной цепи как субстрата, так и фоновых липидов, отрицательным зарядом и кривизной мембраны для активации обоих комплексов I и II.Однако эти комплексы имеют уникальную клеточную локализацию, и анализ HDX-MS выявил различия в способах связывания с мембраной между комплексами I и II, которые, вероятно, вносят вклад в их разные роли.

Дополнительные субъединицы являются неотъемлемой частью сборки и функционирования митохондриального комплекса человека I

1

Сазанов, Л. А. Гигантский молекулярный протонный насос: структура и механизм дыхательного комплекса I. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16 , 375–388 (2015)

CAS PubMed Статья Google ученый

2

Lapuente-Brun, E.и другие. Сборка суперкомплекса определяет поток электронов в митохондриальной цепи переноса электронов. Наука 340 , 1567–1570 (2013)

ADS CAS PubMed Статья Google ученый

3

Вафаи, С. Б. и Мутха, В. К. Митохондриальные нарушения как окна в древнюю органеллу. Nature 491 , 374–383 (2012)

ADS CAS PubMed Статья Google ученый

4

Мораис, В.A. et al. Мутации с потерей функции PINK1 влияют на активность митохондриального комплекса I через разобщение убихинона NdufA10. Наука 344 , 203–207 (2014)

ADS CAS Статья Google ученый

5

Miwa, S. et al. Низкое содержание матричного плеча комплекса I в митохондриях предсказывает продолжительность жизни мышей. Nat. Commun. 5 , 3837 (2014)

ADS CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

6

Херст, Дж.Митохондриальный комплекс I. Annu. Rev. Biochem. 82 , 551–575 (2013)

CAS PubMed Статья Google ученый

7

Виноткумар, К. Р., Чжу, Дж. И Херст, Дж. Архитектура респираторного комплекса млекопитающих I. Nature 515 , 80–84 (2014)

ADS CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

8

Цикерманн, В.и другие. Структурная биология. Механистическое понимание кристаллической структуры митохондриального комплекса I. Science 347 , 44–49 (2015)

ADS CAS Статья Google ученый

9

Чжу Дж., Виноткумар К. Р. и Херст Дж. Структура респираторного комплекса млекопитающих I. Nature 536 , 354–358 (2016)

ADS CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

10

Пальярини, Д.J. et al. Компендиум митохондриальных белков объясняет биологию заболевания, связанного с комплексом I. Ячейка 134 , 112–123 (2008)

CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

11

Барадаран, Р., Беррисфорд, Дж. М., Минхас, Г. С., Сазанов, Л. А. Кристаллическая структура всего дыхательного комплекса I. Nature 494 , 443–448 (2013)

ADS CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

12

Лазару, М., McKenzie, M., Ohtake, A., Thorburn, D. R. & Ryan, M. T. Анализ профилей сборки для субъединиц, кодируемых митохондриальной и ядерной ДНК, в комплекс I. Mol. Клетка. Биол. 27 , 4228–4237 (2007)

CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

13

Рансвик, М. Дж., Фернли, И. М., Скехел, Дж. М. и Уокер, Дж. Э. Присутствие ацильного белка-носителя в НАДН: убихинон оксидоредуктазы из митохондрий бычьего сердца. FEBS Lett. 286 , 121–124 (1991)

CAS PubMed Статья Google ученый

14

Роденбург Р. Дж. Митохондриальный комплекс I-сцепленное заболевание. Biochim. Биофиз. Acta 1857 , 938–945 (2016)

CAS PubMed Статья Google ученый

15

Страуд, Д. А. и др. COA6 представляет собой фактор сборки митохондриального комплекса IV, критический для биогенеза COX2, кодируемого мтДНК. Hum. Мол. Genet. 24 , 5404–5415 (2015)

CAS PubMed Статья Google ученый

16

Кирос, П. М., Лангер, Т. и Лопес-Отин, К. Новые роли митохондриальных протеаз в здоровье, старении и болезнях. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16 , 345–359 (2015)

PubMed Статья CAS Google ученый

17

Эндрюс, Б., Carroll, J., Ding, S., Fearnley, I.M., Walker, J.E. Факторы сборки для мембранного плеча человеческого комплекса I. Proc. Natl Acad. Sci. США 110 , 18934–18939 (2013)

ADS CAS PubMed Статья Google ученый

18

Санчес-Кабальеро, Л., Герреро-Кастильо, С. и Нийтманс, Л. Разбирая сложность сборки митохондриального комплекса I: динамический процесс. Biochim. Биофиз.Acta 1857 , 980–990 (2016)

PubMed Статья CAS Google ученый

19

Кальво, С. Э., Клаузер, К. Р. и Мутха, В. К. MitoCarta2.0: обновленный перечень митохондриальных белков млекопитающих. Nucleic Acids Res. 44 , D1251 – D1257 (2015)

PubMed PubMed Central Статья CAS Google ученый

20

Страуд, Д.A., Formosa, LE, Wijeyeratne, XW, Nguyen, TN & Ryan, MT. Нокаут гена с использованием эффекторных нуклеаз, подобных активатору транскрипции (TALEN), показывает, что белок NDUFA9 человека необходим для стабилизации соединения между мембраной и матриксными плечами комплекса I. J. Biol. Chem. 288 , 1685–1690 (2013)

CAS PubMed Статья Google ученый

21

Formosa, L.E. et al. Характеристика митохондриального FOXRED1 в сборке комплекса дыхательной цепи I. Hum. Мол. Genet. 24 , 2952–2965 (2015)

CAS PubMed Статья Google ученый

22

Мимаки, М., Ван, X., Маккензи, М., Торберн, Д. Р. и Райан, М. Т. Понимание сборки митохондриального комплекса I при здоровье и болезни. Biochim. Биофиз. Acta 1817 , 851–862 (2012)

CAS PubMed Статья Google ученый

23

ДюБридж, Р.B. et al. Анализ мутации в клетках человека с использованием системы челнока вируса Эпштейна-Барра. Мол. Клетка. Биол. 7 , 379–387 (1987)

CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

24

Heide, H. et al. Профилирование комплексома идентифицирует TMEM126B как компонент комплекса сборки митохондриального комплекса I. Cell Metab. 16 , 538–549 (2012)

CAS PubMed Статья Google ученый

25

Фогель, Р.O. et al. Идентификация промежуточных продуктов сборки митохондриального комплекса I путем отслеживания помеченного NDUFS3 демонстрирует точку входа митохондриальных субъединиц. J. Biol. Chem. 282 , 7582–7590 (2007)

CAS PubMed Статья Google ученый

26

Huttlin, E. L. et al. Сеть BioPlex: систематическое исследование человеческого взаимодействия. Ячейка 162 , 425–440 (2015)

CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

27

Рейон, Д.и другие. FLASH-сборка TALEN для высокопроизводительного редактирования генома. Nat. Biotechnol. 30 , 460–465 (2012)

CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

28

Релжик Б. и Страуд Д. А. Стратегии скрининга на TALEN-опосредованное нарушение гена. Methods Mol. Биол. 1419 , 231–252 (2016)

PubMed Статья Google ученый

29

Ран, Ф.A. et al. Геномная инженерия с использованием системы CRISPR-Cas9. Nat. Протоколы 8 , 2281–2308 (2013)

CAS Статья Google ученый

30

Sander, J. D. et al. ZiFiT (Zinc Finger Targeter): обновленный инструмент для проектирования цинковых пальцев. Nucleic Acids Res. 38 , W462–8 (2010)

ADS CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

31

Монтегю, Т.Дж., Круз, Дж. М., Ганьон, Дж. А., Черч, Г. М. и Вален, Э. ШОПЧОП: веб-инструмент CRISPR / Cas9 и TALEN для редактирования генома. Nucleic Acids Res. 42 , W401–7 (2014)

CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

32

Morgenstern, J. P. & Land, H. Передовой перенос генов млекопитающих: ретровирусные векторы с высоким титром с множественными маркерами выбора лекарств и комплементарная линия упаковывающих клеток без хелперов. Nucleic Acids Res. 18 , 3587–3596 (1990)

CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

33

Асин-Перес, Р., Фернандес-Силва, П., Пелеато, М. Л., Перес-Мартос, А. и Энрикес, Дж. А. Активные дыхательные пути митохондриальных суперкомплексов. Мол. Ячейка 32 , 529–539 (2008)

PubMed Статья CAS Google ученый

34

Маккензи, М., Lazarou, M., Thorburn, D. R. & Ryan, M. T. Анализ сборки митохондриальных субъединиц в комплексы дыхательной цепи с использованием электрофореза в полиакриламидном геле Blue Native. Анал. Biochem. 364 , 128–137 (2007)

CAS PubMed Статья Google ученый

35

Виттиг, И., Браун, Х. П. и Шеггер, Х. Блю, родной СТРАНИЦА. Nat. Протоколы 1 , 418–428 (2006)

CAS PubMed Статья Google ученый

36

Шеггер, Х.& von Jagow, G. Электрофорез в трицин-натрийдодецилсульфат-полиакриламидном геле для разделения белков в диапазоне от 1 до 100 кДа. Анал. Biochem. 166 , 368–379 (1987)

Артикул Google ученый

37

Райан, М. Т., Воос, В. и Пфаннер, Н. Анализ импорта белка в митохондрии. Methods Cell Biol. 65 , 189–215 (2001)

CAS PubMed Статья Google ученый

38

Даннинг, К.J. et al. CIA30 человека участвует в ранней сборке митохондриального комплекса I, и мутации в его гене вызывают заболевание. EMBO J. 26 , 3227–3237 (2007)

CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

39

Jänicke, A., Vancuylenberg, J., Boag, PR, Traven, A. & Beilharz, TH ePAT: простой метод пометки аденилированной РНК для измерения длины поли (A) -хвоста и других 3 ‘RACE Приложения. РНК 18 , 1289–1295 (2012)

PubMed PubMed Central Статья CAS Google ученый

40

Harrison, P. F. et al. PAT-seq: метод изучения интеграции динамики 3′-UTR с экспрессией генов в эукариотическом транскриптоме. РНК 21 , 1502–1510 (2015)

CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

41

Фрейзер, А.Э. и Торберн, Д. Р. Биохимический анализ комплексов цепей переноса электронов с помощью спектрофотометрии. Methods Mol. Биол. 837 , 49–62 (2012)

CAS PubMed Статья Google ученый

42

Кулак, Н. А., Пихлер, Г., Парон, И., Нагарадж, Н. и Манн, М. Минимальная обработка инкапсулированных протеомных образцов, применяемая для оценки числа копий в эукариотических клетках. Nat. Методы 11 , 319–324 (2014)

CAS PubMed Статья Google ученый

43

Джонстон, А.J. et al. Вставка и сборка человеческого Tom7 в препротеиновый транслоказный комплекс внешней митохондриальной мембраны. J. Biol. Chem. 277 , 42197–42204 (2002)

CAS PubMed Статья Google ученый

44

Cox, J. & Mann, M. MaxQuant обеспечивает высокую скорость идентификации пептидов, индивидуальную погрешность масс в диапазоне p.p.b. и количественное определение белка в масштабе всего протеома. Nat. Biotechnol. 26 , 1367–1372 (2008)

CAS Статья Google ученый

45

Cox, J. et al. Andromeda: поисковая машина пептидов, интегрированная в среду MaxQuant. J. Proteome Res. 10 , 1794–1805 (2011)

ADS CAS PubMed Статья Google ученый

46

Gagnon-Bartsch, J. A. & Speed, T. P. Использование контрольных генов для коррекции нежелательных вариаций в данных микрочипа. Биостатистика 13 , 539–552 (2012)

PubMed PubMed Central Статья Google ученый

47

Лик, Дж. Т. и Стори, Дж. Д. Выявление гетерогенности в исследованиях экспрессии генов с помощью анализа суррогатных переменных. PLoS Genet. 3 , 1724–1735 (2007)

CAS Статья Google ученый

48

Мюнх, К.& Harper, J. W. Ответ митохондриального развернутого белка контролирует процессинг и трансляцию матричной пре-РНК. Nature 534 , 710–713 (2016)

ADS PubMed PubMed Central Статья CAS Google ученый

49

Wrobel, L. et al. Неверно направленные митохондриальные белки активируют протеостатический ответ в цитозоле. Природа 524 , 485–488 (2015)

ADS CAS PubMed Статья Google ученый

50

Hubner, N.C. et al. Количественная протеомика в сочетании с BAC TransgeneOmics выявляет белковые взаимодействия in vivo. J. Cell Biol. 189 , 739–754 (2010)

CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

51

Тушер, В. Г., Тибширани, Р. и Чу, Г. Анализ значимости микрочипов, применяемых к отклику на ионизирующее излучение. Proc. Natl Acad. Sci. США 98 , 5116–5121 (2001)

ADS CAS МАТЕМАТИКА Статья Google ученый

52

Мерико, Д., Isserlin, R., Stueker, O., Emili, A. & Bader, G.D. Карта обогащения: сетевой метод визуализации и интерпретации обогащения набора генов. PLoS One 5 , e13984 (2010)

ADS PubMed PubMed Central Статья CAS Google ученый

53

Страуд, Д. А. и др. Состав и топология встречающейся структуры эндоплазматического ретикулума и митохондрий. J. Mol. Биол. 413 , 743–750 (2011)

CAS PubMed Статья Google ученый

54

Геберт, Н.и другие. Двойная функция Sdh4 в дыхательной цепи и протеин-транслоказы TIM22 внутренней митохондриальной мембраны. Мол. Ячейка 44 , 811–818 (2011)

CAS PubMed Статья Google ученый

55

Richter, V. et al. Структурный и функциональный анализ MiD51, рецептора динамина, необходимого для деления митохондрий. J. Cell Biol. 204 , 477–486 (2014)

CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

56

Шнайдер, К.A., Rasband, W. S. & Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 лет анализа изображений. Nat. Методы 9 , 671–675 (2012)

CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

57

Ostergaard, E. et al. Дефицит комплекса I дыхательной цепи из-за мутаций NDUFA12 как новая причина синдрома Ли. J. Med. Genet. 48 , 737–740 (2011)

CAS PubMed Статья Google ученый

58

Assouline, Z.и другие. Постоянный и сходный дефект сборки комплекса I дыхательной цепи митохондрий позволяет быстро идентифицировать мутации NDUFS4 у пациентов с синдромом Ли. Biochim. Биофиз. Acta 1822 , 1062–1069 (2012)

CAS PubMed Статья Google ученый

59

Haack, T. B. et al. Скрининг мутаций 75 генов-кандидатов в 152 случаях дефицита комплекса I позволяет выявить патогенные варианты в 16 генах, включая NDUFB9. J. Med. Genet. 49 , 83–89 (2012)

CAS PubMed Статья Google ученый

60

Кирби, Д. М. и др. Мутации NDUFS6 являются новой причиной летального дефицита митохондриального комплекса I у новорожденных. J. Clin. Инвестировать. 114 , 837–845 (2004)

CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

61

ван ден Бош, Б.J. et al. Дефектный NDUFA9 как новая причина неонатально летального заболевания комплекса I. J. Med. Genet. 49 , 10–15 (2012)

CAS PubMed Статья Google ученый

62

Hoefs, S.J. et al. Мутации NDUFA10 вызывают дефицит комплекса I у пациента с болезнью Ли. Eur. J. Hum. Genet. 19 , 270–274 (2011)

PubMed Статья Google ученый

63

Анжебо, К.и другие. Мутация в NDUFA13 / GRIM19 приводит к раннему началу гипотонии, дискинезии и сенсорной недостаточности, а также нестабильности митохондриального комплекса I. Hum. Мол. Genet. 24 , 3948–3955 (2015)

CAS PubMed Статья Google ученый

64

Haack, T. B. et al. Молекулярная диагностика дефицита митохондриального комплекса I с использованием секвенирования экзома. J. Med. Genet. 49 , 277–283 (2012)

CAS PubMed Статья Google ученый

65

Шехата, Б.M. et al. Секвенирование экзома пациентов с гистиоцитоидной кардиомиопатией выявляет de novo NDUFB11 мутацию, которая играет роль в патогенезе гистиоцитоидной кардиомиопатии. Am. J. Med. Genet. A. 167A , 2114–2121 (2015)

PubMed Статья CAS Google ученый

66

Fernandez-Moreira, D. et al. Х-сцепленный NDUFA1 мутации гена, связанные с митохондриальной энцефаломиопатией. Ann. Neurol. 61 , 73–83 (2007)

CAS PubMed Статья Google ученый

67

Peralta, S. et al. Частичный дефицит комплекса I из-за условного удаления Ndufa5 в ЦНС приводит к легкой хронической энцефалопатии, но не увеличивает окислительное повреждение. Hum. Мол. Genet. 23 , 1399–1412 (2014)

CAS PubMed Статья Google ученый

Топология комплексов высшего порядка, связанных с концентраторами мозга в человеческих коннектомах

Описание данных

Мы используем данные для двух консенсусных коннектомов , которые мы сгенерировали в ¹ на сервере коннектома в Будапеште 3.0 ^40,41 на основе данных диффузионной МРТ от Human Connectome Project (HCP) для 500 человек ²⁵ . Сервер использует инструменты картирования мозга для парцелляции, трактографии и построения графиков ^13,42,43 для сопоставления экспериментальных данных каждого человека. Затем консенсусный коннектом определяется как набор ребер, общих для выбранной группы людей. Как описано в ⁴¹ , мы можем выбрать размер группы и биологический пол индивидов, а также несколько других параметров, например.g., количество волокон, запущенных в фазе трактографии, что приводит к другому результату. В частности, с соответствующими настройками на сервере мы определяем взвешенные сети всего мозга, которые являются общими для 100 испытуемых женского пола, F-коннектом и аналогично M-коннектом , который является общим для 100 испытуемых мужского пола. Каждый коннектом состоит из \ (N = 1015 \) узлов, аннотированных как анатомические области мозга, и взвешенных ребер, вес которых определяется числом волокон между рассматриваемой парой областей мозга, нормированным на среднюю длину волокна.6 \) волокна отслеживаются и устанавливают минимальный вес, равный четырем. Соответствующие базовые сети Fc-сеть и Mc-сеть определены как подграфы F- и M-коннектомов, соответственно, содержащие ведущие концентраторы и их первые соседние узлы, а также все ребра между этими узлами. Между тем, концентраторы определяются в соответствии с критериями топологического измерения, как описано ниже и в разделе «Результаты».

Анализ топологии и определение величин

Мы применяем алгоритм Брона – Кербоша ⁴⁴ для анализа структуры симплициальных комплексов, т.е.е., кликовые комплексы, в ядерных Fc- и Mc-коннектомах. В этом контексте симплекс порядка q является полным графом (кликой) из \ (q + 1 \) вершин \ (\ sigma _q = \ left \ langle i_0, i_1, i_2, …, i_ {q} \ right \ rangle \). Тогда симплекс \ (\ sigma _r \) порядка \ (r r вершин симплекса \ (\ sigma _q \), является гранью симплекса \ (\ sigma _q \). Таким образом, симплекс \ (\ sigma _q \) содержит грани всех порядков из \ (r = 0 \) (узлы), \ (r = 1 \) (ребра), \ (r = 2 \) (треугольники), \ (r = 3 \) (тетраэдры) и т. д. до порядка \ (r = q-1 \).Набор симплексов, соединенных общими гранями разного порядка, составляет симплициальный комплекс . Порядок симплициального комплекса задается порядком наибольшей клики в этом комплексе, а \ (q_ {max} \) — наибольший порядок всех симплициальных комплексов. Имея матрицу смежности графа, с помощью алгоритма мы строим матрицу инцидентности \ ({\ Lambda} \), которая содержит идентификаторы всех симплексов и идентификаторы узлов, составляющих каждый симплекс. Располагая этой информацией, мы вычисляем три структурных вектора ^45,46 для характеристики архитектуры симплициальных комплексов:

• Первый структурный вектор (FSV): \ ({\ mathbf {Q}} = \ {Q_0, Q_1, \ ldots Q_ {q_ {max} -1}, Q_ {q_ {max}} \} \) , где \ (Q_q \) — количество q -соединенных компонентов;

• Второй структурный вектор (SSV): \ (\ mathbf {N_s} = \ {n_0, n_1, \ ldots n_ {q_ {max} -1}, n_ {q_ {max}} \} \), где \ (n_q \) — количество симплексов от уровня q вверх;

• Третий структурный вектор (TSV): компонент \ ({\ hat {Q}} _ q \ Equiv 1- {Q_q} / {n_q} \) количественно определяет степень связности симплексов на уровне топологии q .i, 0} \ right) \) — количество вершин, имеющих ненулевую запись на уровне q во всем графе. Таким образом, топологическая энтропия (2) измеряет степень взаимодействия между вершинами, приводящую к минимуму на заданном уровне топологии. Между тем, ближе к пределам \ (q \ rightarrow 0 \) и \ (q \ rightarrow q_ {max} \) появление независимых клик приводит к более высокой энтропии на этом уровне.

  Кроме того, мы вычисляем вектор \ ({\ mathbf {f}} = \ left \ {f_0, f_1, \ ldots f_ {q_ {max}} \ right \} \), который определяется ⁴⁷ таких что \ (f_q \) представляет собой симплексов и граней на уровне q .Учитывая, что свободный симплекс размера \ (n> q \) имеет соответствующее комбинаторное количество граней порядка q , компонент \ (f_q \), таким образом, содержит информацию о фактическом количестве общих граней между симплексами на уровень q . Таким образом, с помощью этих мер алгебраической топологии мы можем идентифицировать все симплексы с узлами (областями мозга), которые их образуют, а также то, как эти симплексы взаимодействуют друг с другом посредством совместного использования определенных групп узлов.

  Сетевая структура и гиперболичность

  Нижележащий топологический граф представляет собой 1-скелет симплициального комплекса. Используя методы теории графов ⁴⁸ , мы определяем корреляции степень-степень, которые имеют отношение к наблюдаемому «поведению богатого клуба» хабов в глобальном коннектоме ^1,27,30,31 . Точнее, для каждого узла в рассматриваемой сети среднее количество ребер его ближайших соседних узлов наносится на график в зависимости от степени узла.\ му \. \ end {align} $$

  (3)

  Здесь положительные значения показателя степени \ (\ mu> 0 \) указывают ассортативных корреляций , в то время как \ (\ mu <0 \) соответствует дезассортативному смешиванию , и \ (\ mu = 0 \ ) предполагает отсутствие корреляций узлов. Мы анализируем Fc- и Mc-графы, рассматривая ребра, которые остаются после применения различных весовых порогов. Распределение веса P ( w ) определяется для всех базовых сетей, см. Результаты.

  Кроме того, наличие гиперболичности или отрицательной кривизны в графе мозга является мерой близости узлов (в метрическом пространстве графа), которая способствует передаче сигналов между различными областями мозга. Мы используем 4-точечный критерий Громова для гиперболических графов ⁴⁹ , чтобы определить параметр гиперболичности \ (\ delta _ {max} \) этих графов. А именно, для каждого набора из 4 узлов ( A , B , C , D ) в \ (\ delta \) — гиперболическом графе G , упорядоченное соотношение между суммами кратчайших расстояния по путям \ ({{\ mathscr {S}}} \ Equiv d (A, B) + d (C, D) \ le {{\ mathscr {M}}} \ Equiv d (A, C) + d ( B, D) \ le {{\ mathscr {L}}} \ Equiv d (A, D) + d (B, C) \) означает, что

  $$ \ begin {align} \ delta (A, B, C, D) \ Equiv \ frac {{\ mathscr {L}}} — {{\ mathscr {M}}}} {2} \ le \ delta (G) \; .9 \)) 4-кортежей узлов в каждом графе, и построив \ (\ delta (A, B, C, D) \) против соответствующего минимального расстояния \ (d_ {min} \), мы получим \ (\ delta (G) \) как верхнюю границу \ (\ delta _ {max} = max_G \ {\ delta (A, B, C, D) \} \).

  Сравнительный анализ белковых комплексов человека для исследования систем, связанных с лекарствами, и оценки предсказанных белковых комплексов

  Белковые комплексы являются ключевыми объектами для выполнения клеточных функций. Заболевания человека также связаны с некоторыми специфическими белковыми комплексами человека.Фактически, белковые комплексы человека широко используются для аннотации функций белков, вывода о взаимодействии белков человека, прогнозирования генов заболеваний и т. Д. Поэтому очень желательно создать обновленный каталог человеческих комплексов для поддержки исследований в этих приложениях. Ожидается, что белковые комплексы из разных баз данных будут сильно избыточными. В этой статье мы разработали набор кратких операций для компиляции этих избыточных человеческих комплексов и создали исчерпывающий каталог под названием CHPC2012 (Каталог белковых комплексов человека).CHPC2012 обеспечивает больший охват белков и белковых комплексов, чем эти отдельные базы данных. Также подтверждено, что это набор комплексов высокого качества, поскольку его комлексные белковые ассоциации имеют высокую степень перекрытия с белок-белковыми взаимодействиями (PPI) в различных существующих базах данных PPI. Мы продемонстрировали два различных применения CHPC2012, а именно: исследование взаимосвязи между белковыми комплексами и системами, связанными с лекарствами, и оценка качества предсказанных белковых комплексов.В частности, CHPC2012 дает больше информации о разработке лекарств. Например, белки, входящие в состав нескольких комплексов (перекрывающиеся белки), являются потенциальными мишенями для лекарств; сеть лекарственного комплекса используется для исследования лекарств с множеством мишеней и лекарств-взаимодействий; а сети комплексных лекарств для конкретных болезней предоставят новые ключи к репозиционированию лекарств. Мы считаем, что с помощью этого обновленного эталонного набора белковых комплексов человека каталог CHPC2012 может улучшить исследования белковых взаимодействий, функций белков, человеческих заболеваний, лекарств и связанных областей исследований.Комплексы CHPC2012 можно загрузить с http://www1.i2r.a-star.edu.sg/xlli/CHPC2012/CHPC2012.htm.

  Комплексы Argonaute2 несут популяцию циркулирующих микроРНК, независимых от пузырьков в плазме человека

  Abstract

  МикроРНК (миРНК) циркулируют в кровотоке в высокостабильной внеклеточной форме и разрабатываются как биомаркеры крови для рака и других заболеваний. Однако механизм, лежащий в основе их замечательной стабильности в богатой РНКазами среде крови, не совсем понятен.Текущая модель в литературе утверждает, что циркулирующие miRNAs защищены инкапсуляцией в мембраносвязанные везикулы, такие как экзосомы, но это систематически не изучалось. Мы использовали дифференциальное центрифугирование и эксклюзионную хроматографию в качестве ортогональных подходов для характеристики циркулирующих комплексов миРНК в плазме и сыворотке человека. Мы неожиданно обнаружили, что большинство циркулирующих miRNA кофракционируется с белковыми комплексами, а не с везикулами. miRNA были также чувствительны к обработке плазмы протеазами, что указывает на то, что белковые комплексы защищают циркулирующие miRNA от РНКаз плазмы.Дальнейшая характеристика показала, что Argonaute2 (Ago2), ключевой эффекторный белок miRNA-опосредованного сайленсинга, присутствует в плазме человека и элюируется miRNA плазмы при эксклюзионной хроматографии. Более того, иммунопреципитация Ago2 из плазмы легко восстанавливает не связанные с пузырьками миРНК плазмы. Большинство изученных miRNAs совместно очищены с рибонуклеопротеидным комплексом Ago2, но меньшая часть специфических miRNAs ассоциирована преимущественно с везикулами. Наши результаты выявили две популяции циркулирующих миРНК и предполагают, что циркулирующие комплексы Ago2 являются механизмом, ответственным за стабильность плазменных миРНК.Наше исследование имеет важное значение для разработки биомаркерных подходов, основанных на захвате и анализе циркулирующих miRNA. Кроме того, идентификация внеклеточных комплексов Ago2-miRNA в плазме повышает вероятность того, что клетки выпускают функциональный miRNA-индуцированный комплекс сайленсинга в кровоток.

  МикроРНК (миРНК) представляют собой класс некодирующих РНК из приблизительно 22 нуклеотидов, которые опосредуют посттранскрипционную регуляцию генов путем связывания и репрессии со специфическими мишенями матричной РНК.Мы и другие ранее продемонстрировали, что miRNAs присутствуют в кровотоке человека в бесклеточной форме и что измененные профили miRNA в плазме и сыворотке наблюдаются при раке и других заболеваниях (1-9). Это, наряду с открытием того, что miRNAs удивительно стабильны в плазме, несмотря на высокую активность циркулирующей РНКазы (1), предполагает, что miRNA могут быть развиты в мощный новый класс биомаркеров крови.

  Механизм, лежащий в основе неожиданной стабильности бесклеточных miRNAs в богатой РНКазой среде крови, систематически не исследовался, хотя он имеет важные последствия для развития биомаркеров miRNA и потенциальных биологических функций циркулирующих miRNA (10).В настоящее время доминирующей моделью стабильности циркулирующей miRNA является то, что miRNA высвобождаются из клеток в мембраносвязанных пузырьках, которые защищают их от активности РНКазы крови. Везикулы, предложенные в качестве носителей циркулирующих миРНК, включают экзосомы, которые представляют собой везикулы размером от 50 до 90 нм, возникающие из мультивезикулярных тел и высвобождаемые посредством экзоцитоза (11), а также более крупные мембраносвязанные частицы, включая микровезикулы размером до 1 мкм (12, 13). Эта модель подтверждается наблюдением, что клетки, растущие в культуре, выделяют экзосомы, которые связаны с miRNA (6, 14–16), и обнаружением miRNA, связанных с экзосомами и микровезикулами, выделенными из плазмы и сыворотки (7, 13, 17, 18). ).Однако, насколько нам известно, систематическое исследование физиологического состояния циркулирующих miRNAs в плазме еще не получено, и неизвестно, является ли инкапсуляция везикул единственным механизмом стабильности циркуляции miRNA или существуют другие потенциально более преобладающие механизмы.

  Мы сообщаем здесь о систематическом исследовании физического состояния miRNAs в плазме и сыворотке, которое обеспечивает понимание механизмов, отвечающих за стабильность циркулирующей miRNA. Мы показываем, что инкапсулированные в пузырьки miRNAs представляют только незначительную часть циркулирующих miRNAs.В частности, мы сообщаем, что значительная часть циркулирующей miRNA связана с Argonaute2 (Ago2), эффекторным компонентом miRNA-индуцированного комплекса сайленсинга, который непосредственно связывает miRNAs и обеспечивает репрессию матричной РНК в клетках (19-22). Эти результаты существенно пересматривают текущее понимание физиологического состояния и основы стабильности циркулирующих miRNAs, и мы обсуждаем значение для будущих исследований биомаркеров miRNA и внеклеточной функции miRNA.

  Результаты

  Циркулирующие миРНК не обладают внутренней устойчивостью к РНКазам плазмы.

  При систематическом подходе к идентификации механизмов, которые защищают циркулирующие miRNAs, первая гипотеза, которую мы исследовали, заключалась в том, что циркулирующие miRNAs по своей природе устойчивы к активности РНКазы в крови. Если миРНК, происходящие из плазмы, обладают внутренней устойчивостью, ожидается, что добавление очищенной миРНК плазмы к свежим образцам плазмы приведет к увеличению количества миРНК. Однако мы наблюдали, что очищенная миРНК плазмы быстро разлагалась при инкубации с плазмой, тогда как предыдущее ингибирование активности РНКазы плазмы блокировало эту деградацию (рис.S1). Таким образом, мы пришли к выводу, что циркулирующие miRNA не обладают внутренней устойчивостью к активности эндогенных РНКаз.

  Циркулирующие миРНК не ограничиваются пузырьками.

  Затем мы проверили гипотезу о том, что циркулирующие miRNAs в первую очередь инкапсулированы в мембраносвязанные везикулы. Исследования, в которых использовалось дифференциальное ультрацентрифугирование для очистки везикул, предположили, что микровезикулы и экзосомы служат переносчиками циркулирующих миРНК и защищают их от активности РНКазы (6, 7, 13, 17).Однако, насколько нам известно, количественный анализ доли циркулирующих miRNAs, которые фактически ассоциированы с пузырьками, не проводился.

  Чтобы определить степень, в которой циркулирующие миРНК связаны с микровезикулами и / или экзосомами, мы использовали дифференциальное ультрацентрифугирование для очистки циркулирующих везикул из бесклеточной бедной тромбоцитами плазмы, полученной от трех здоровых людей (рис. S2 A ). Бедная тромбоцитами плазма была выбрана для минимизации остаточных тромбоцитов, которые возникают при стандартных протоколах плазмы.Бедная тромбоцитами плазма была приготовлена ​​путем двукратного центрифугирования антикоагулированной крови, что снижает уровень тромбоцитов более чем в 100 раз по сравнению с нормальной цельной кровью (23) до 1000–2000 тромбоцитов / мкл, как измерено автоматическим полным подсчетом клеток крови. Бедную тромбоцитами плазму обрабатывали в течение 1 часа после забора крови и использовали свежую (никогда не замораживали) для ультрацентрифугирования в течение 4 часов после забора. Мы подтвердили восстановление везикул, соответствующих по размеру и морфологии экзосомам и микровезикулам с помощью ЭМ (рис.1 А ). Используя количественную ОТ-ПЦР (qRT-PCR), мы проанализировали осадок везикул и супернатанты с низким содержанием везикул на три хорошо охарактеризованных циркулирующих miRNA: miR-16, miR-92a и let-7a (1, 8, 24). Мы определили копии miRNA путем абсолютной количественной оценки и нормализовали между образцами с использованием синтетических олигонуклеотидов miRNA Caenorhabditis elegans , которые были добавлены в каждый образец после инактивации РНКазы (1, 25). Мы наблюдали, что примерно 95% циркулирующих miR-16 и miR-92a не осаждались везикулами (рис.1 B ). Напротив, мы обнаружили от 40% до 75% циркулирующего let-7a в осадке везикул. Таким образом, результаты дифференциального ультрацентрифугирования позволяют предположить, что в плазме существуют по крайней мере две популяции циркулирующих miRNA: те, которые прочно связаны с богатым пузырьками осадок, и те, которые не связаны.

  Рис. 1.

  Циркулирующие миРНК не ограничиваются пузырьками. ( A ) Циркулирующие везикулы очищали от плазмы дифференциальным ультрацентрифугированием. Восстановление везикул, соответствующих по размеру и морфологии экзосомам и микровезикулам, было подтверждено с помощью ЭМ.Показана репрезентативная микрофотография. ( B ) Осадок плазменных везикул (серые столбцы) и супернатант с низким содержанием везикул (белые столбцы) от указанных доноров анализировали на miR-16, miR-92a и let-7a с использованием TaqMan qRT-PCR. Для каждой miRNA стандартная кривая соответствующего синтетического олигонуклеотида позволяла проводить абсолютное количественное определение копий miRNA. Столбцы представляют собой относительные копии miRNA, выделенные из осадка и супернатанта.

  Хотя ультрацентрифугирование успешно извлекло везикулы из плазмы, возможно, что miRNA осталась в супернатанте в результате неполного восстановления везикул или разрыва везикул в условиях высокой силы ультрацентрифугирования.Чтобы устранить эти предостережения, мы применили эксклюзионную хроматографию как ортогональный подход для характеристики циркулирующих miRNAs (Fig. S2 B ). Мы фракционировали миРНК-содержащие частицы в мягких условиях с помощью смолы Sephacryl S-500. Основываясь на стандартах везикул и белков, мы определили, что наша колонка разделяет частицы диаметром приблизительно от 1 до 120 нм, при этом частицы размером 120 нм и более элюируются около фракции 8, а частицы 1 нм или меньше элюируются около фракции 20 (рис. 2 D ). и рис.S3). Свежеприготовленную плазму получали от трех здоровых доноров в течение 1 часа после забора крови, а незамороженные образцы плазмы наносили на колонку в течение 4 часов после забора крови. Копии miR-16, miR-92a и let-7a были количественно определены в каждой фракции с помощью qRT-PCR и нормализованы к синтетическим miRNA C. elegans с добавлением добавок для корректировки технических различий между фракциями в экстракции miRNA. эффективность. Содержание белка в каждой фракции измеряли по поглощению при 280 нм.

  Рис.2.

  Две популяции циркулирующих микроРНК идентифицируют с помощью эксклюзионной хроматографии. ( A — C ) Образцы плазмы от указанных доноров фракционировали на колонке с сефакрилом S-500. Фракции анализировали на miR-16 (синий ромб), miR-92a (оранжевый треугольник) и let-7a (красный квадрат) с использованием абсолютного количественного определения с помощью TaqMan qRT-PCR. Обилие белка определяли по поглощению при 280 нм (A280; черный кружок). Для miRNA значения оси y указывают относительные копии miRNA в каждой фракции.Для белка те же значения оси и указывают на чтение A280. ( D ) Профили элюции везикул (средний диаметр 100 нм), стандартов BSA и тирозина определяли с помощью A280. Точки представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение повторяющихся независимых анализов.

  Мы наблюдали, что две популяции циркулирующих miRNAs разделились в зависимости от размера их ассоциированных частиц. Во всех трех образцах плазмы miR-16 и miR-92a софракционировали с относительно небольшими белковыми компонентами плазмы во фракциях с 15 по 21 (рис.2 A — C ). Напротив, большая часть let-7a элюировалась ранее во фракциях с 8 по 10, которые, как ожидается, будут содержать большие комплексы и везикулы, и только низкие уровни let-7a были обнаружены в поздних фракциях. Мы также проанализировали сыворотку, полученную параллельно от одних и тех же доноров ( SI Results ). Мы наблюдали сходное распределение сывороточных miRNA, хотя miR-16 и miR-92a были обнаружены в ранних фракциях сыворотки (Fig. S4 A — C ). Как и в нашем эксперименте по ультрацентрифугированию, результаты для miR-16 и miR-92a показывают, что эти miRNA не связаны с пузырьками.Вместо этого наши данные предполагают, что специфические циркулирующие miRNAs существуют в составе рибонуклеопротеидного комплекса.

  Чтобы проверить, может ли популяция ранней элюции miRNA представлять диапазон размеров, соответствующий везикулам, мы определили профиль элюции синтетических липидных везикул с номинальным средним диаметром 100 нм (Fig. 2 D ). Мы также проанализировали элюцию БСА и тирозина в качестве стандартов белка и низкомолекулярных соединений соответственно. Когда мы сравнивали элюцию стандартов с распределением miRNA в плазме, мы наблюдали, что let-7a элюируется во фракциях, согласующихся с ассоциацией с везикулами (фракции 8-10).Напротив, наш стандарт везикул не присутствовал в поздних фракциях, которые содержат большую часть miR-16 и miR-92a. Эти результаты согласуются с заключением, что существуют ассоциированные с пузырьками и не связанные с пузырьками популяции циркулирующих miRNAs. Наши данные убедительно подтверждают гипотезу о том, что по крайней мере две циркулирующие miRNAs — miR-16 и miR-92a — преимущественно содержатся в составе рибонуклеопротеинового комплекса в плазме и существенно не связаны с экзосомами.

  Чувствительный к протеазе комплекс специфически стабилизирует циркулирующие миРНК, присутствующие во фракциях поздней хроматографии.

  Поскольку наш анализ фракционирования предполагает, что miR-16 и miR-92a находятся в составе рибонуклеопротеинового комплекса, мы исследовали, отвечает ли такой комплекс за стабильность этих miRNA в плазме. Мы предположили, что если белковый комплекс стабилизирует циркулирующие миРНК, протеолитическое расщепление этого комплекса высвободит миРНК и сделает их чувствительными к деградации под действием РНКаз плазмы. Однако нельзя ожидать, что miRNAs, стабилизированные посредством везикулярного механизма, будут проявлять чувствительность к протеолизу.Мы инкубировали необработанную плазму и плазму, обработанную протеиназой К, не содержащей ДНКазы / РНКазы, при 55 ° C, так как это были условия, необходимые для обработки протеиназой К. Мы наблюдали, что miR-16 и miR-92a быстро дестабилизировались и деградировали в присутствии протеиназы K, но были стабильными в необработанном контроле (фиг. 3 A и B ). МикроРНК let-7a с ранним элюированием не была чувствительна к обработке протеиназой К, не обнаруживая существенных различий между необработанными и обработанными образцами (рис.3 С ). Интересно, что let-7a показала медленное зависящее от времени снижение в необработанных и обработанных образцах плазмы, что, как мы предполагаем, могло быть результатом потери целостности везикул, вызванной инкубацией при 55 ° C. Результаты демонстрируют, что чувствительный к протеазе комплекс специфически стабилизирует циркулирующие миРНК с поздним элюированием, но не с ранним элюированием, и дополнительно подтверждают модель рибонуклеопротеинового комплекса, который отвечает за стабильность невезикулярных циркулирующих миРНК.

  Рис.3.

  Чувствительный к протеазе комплекс защищает микроРНК с поздним элюированием от активности РНКазы плазмы. Плазма не обрабатывалась (закрашенные символы) или обрабатывалась протеиназой K (5 мг / мл; светлые символы) при 55 ° C. В указанное время отбирали аликвоты и анализировали на miR-16 ( A ), miR-92a ( B ) и let-7a ( C ) с помощью qRT-PCR. Точки представляют копии miRNA, обнаруживаемые в каждый момент времени относительно соответствующего 0-минутного образца.

  Большинство циркулирующих миРНК имеют профиль эксклюзионной хроматографии, совместимый с рибонуклеопротеиновыми комплексами, не связанными с везикулами.

  Хотя мы обнаружили две популяции циркулирующих miRNAs, наши начальные эксперименты сосредоточились только на трех miRNAs. Поэтому мы стремились определить, как др. Циркулирующие miRNAs распределяются в этих популяциях. Мы использовали наборы профилей микроРНК qRT-PCR для измерения количества 375 микроРНК в плазме и фракциях сыворотки от одного донора, h2-7. Чтобы увеличить количество РНК, которое можно было использовать, соседние пары фракций были объединены на уровне РНК перед анализом.

  Платформы для профилирования

  miRNA имеют специфичные для анализа пределы линейного количественного определения, и многие циркулирующие miRNA присутствуют на низких уровнях, которые могут быть близкими или ниже таких пределов.Чтобы обеспечить надежность наших данных профилирования, мы выполнили анализ разведения циркулирующих миРНК, очищенных из нефракционированной плазмы или сыворотки от одного и того же донора, чтобы эмпирически определить пределы линейного количественного определения и обнаружения, а также эффективность ПЦР для 375 проанализированных микроРНК. Основываясь на анализе разведения, мы удалили нелинейные анализы из дальнейшего анализа и выполнили неспецифическую фильтрацию, чтобы удалить недостоверные значения C _T , выходящие за пределы обнаружения конкретного анализа. Мы надежно обнаружили 128 и 136 miRNA в нефракционированной плазме и сыворотке соответственно (таблицы S1 и S2), что было сопоставимо с нашим анализом профилей в предыдущем исследовании (1).После проведения хроматографии и возникновения связанного с ней эффекта разжижения 88 miRNA в плазме и 66 сывороточных miRNA были надежно определены количественно по крайней мере в одной фракции. Для этих микроРНК мы рассчитали относительную количественную оценку (RQ) для всех пулов фракций на основании эффективности ПЦР для конкретного анализа. Иерархическая кластеризация выполнялась независимо на наборах данных профилирования плазмы и сыворотки (рис. 4 A и рис. S4 D ). Этот анализ выявил три широких класса циркулирующих miRNA: те, которые обогащены фракциями крупных частиц с 6 по 11, те, которые обогащены фракциями малых частиц с 14 по 21, и те, которые распределены между обоими пиками.Примерно 15% обнаруженных циркулирующих миРНК в плазме и сыворотке были обогащены в ранних фракциях, что соответствует везикулам. Однако большинство циркулирующих миРНК было обнаружено в более мелких фракциях частиц. Мы наблюдали, что 66% (плазма) и 68% (сыворотка) обнаруживаемых miRNA были обогащены в поздних фракциях, что согласуется с рибонуклеопротеиновым комплексом, а остальные miRNA присутствовали на аналогичных уровнях в ранних и поздних пиках. Более того, 43% (плазма) и 27% (сыворотка) обнаруживаемых miRNA были обнаружены только в поздних фракциях.

  Рис. 4.

  Циркулирующие миРНК преимущественно находятся во фракциях, согласующихся с рибонуклеопротеидными комплексами. ( A ) RQ циркулирующих miRNA, профилированные в указанных пулах фракций плазмы (донор h2-7), представлены в виде тепловой карты. Затенение представляет уровень miRNA, обнаруженный в данном пуле фракции, относительно общего количества этой miRNA, обнаруженного во всех пулах. Над тепловой картой представлена ​​смесь стандарта везикул и соответствующего профиля элюции белков плазмы из фиг. 2 (значения везикул и белка A280 масштабированы, поэтому пики имеют одинаковую высоту).Иерархическая кластеризация упорядоченных миРНК, как показано на дендрограмме. Названия анализов окрашены в три класса: с ранним элюированием (красный), с поздним элюированием (синий) и с элюированием по обоим пикам (фиолетовый). Жирные миРНК измеряли с помощью индивидуальных тестов TaqMan qRT-PCR. Проверка уровней miR-142–3p ( B ), miR-150 ( C ) и miR-122 ( D ) в долях плазмы (синие ромбы) и сыворотки (красные квадраты) от донора h2- 7. Точки представляют собой относительные копии miRNA во фракциях, как определено TaqMan qRT-PCR и абсолютным количественным определением.

  Чтобы проверить результаты нашего эксперимента по профилированию, мы сравнили данные профилирования для let-7a, miR-16 и miR-92a (рис. 4 A и рис. S4 D ) с нашим предыдущим анализом тот же донор с помощью индивидуальных анализов qRT-PCR (фиг. 2 C и фиг. S4 C ). В целом, RQ этих miRNA, определенный с помощью профилирования miRNA, соответствовал относительному количеству копий, измеренному TaqMan qRT-PCR во фракциях плазмы и сыворотки. Единственным исключением был let-7a в профилировании плазмы, который не прошел нашу неспецифическую фильтрацию в массиве qRT-PCR и был исключен из анализа профилей плазмы.Это может быть объяснено более низкой чувствительностью платформы массива qRT-PCR (в результате меньшего количества вводимой РНК на анализ) по сравнению с отдельными анализами qRT-PCR miRNA, используемыми в нашем более раннем анализе.

  Для дальнейшего подтверждения распределений miRNA, идентифицированных с помощью профилирования, мы выбрали три дополнительных miRNA из данных профилирования для подтверждения с помощью индивидуальных тестов TaqMan qRT-PCR. miRNAs были выбраны для представления каждого класса циркулирующих miRNA, определяемых кластеризацией: miR-142–3p (раннее элюирование), miR-122 (позднее элюирование) и miR-150 (распределенное в обоих пиках).Число копий этих микроРНК определяли в каждой фракции от одного и того же профилированного донора. В соответствии с нашими результатами профилирования, мы наблюдали, что miR-142–3p преимущественно локализуется в ранних фракциях 8 и 9 в плазме и сыворотке (Fig. 4 B ). Анализ TaqMan оказался более чувствительным, чем платформа для профилирования, а также обнаружил низкий уровень miR-142–3p в более поздних фракциях. Распределение miR-150 и miR-122, обнаруженное TaqMan, также соответствовало профилированию как в плазме, так и в сыворотке, подтверждая, что miR-150 была равномерно распределена, тогда как miR-122 была ограничена поздними фракциями (рис.4 C и D ). Мы наблюдали сходное распределение этих miRNAs у наших двух других доноров, хотя miR-142–3p демонстрировала индивидуальную изменчивость ( SI Results и Fig. S5). Таким образом, с помощью множественных анализов miRNA мы продемонстрировали, что распределения циркулирующих miRNA, обнаруженные с помощью профилирования, были достоверными и воспроизводимыми в пределах обнаружения для платформы.

  Циркулирующие миРНК связаны с циркулирующими комплексами Ago2.

  В клетках млекопитающих зрелые miRNA загружаются в комплексы Argonaute (Ago), которые обеспечивают активность молчания матричной РНК (26).Однако о бесклеточных комплексах Ago в кровотоке ранее не сообщалось. На основании наших наблюдений, что большинство циркулирующих miRNAs фракционируется способом, совместимым с рибонуклеопротеидным комплексом, мы предположили, что эти miRNAs присутствуют в циркулирующих комплексах Ago. У млекопитающих идентифицировано четыре белка Ago, из которых Ago2 охарактеризован лучше всего. Чтобы определить, присутствуют ли белки Ago в плазме, мы провели иммунопреципитацию с последующим иммуноблоттингом с антителами против каждого из четырех известных белков Ago человека.Детергент не добавляли во время иммунопреципитации, чтобы избежать потенциального лизиса плазменных везикул. Хотя мы не смогли обнаружить Ago1, Ago3 или Ago4 с доступными антителами, мы наблюдали Ago2 в плазме человека (рис. 5 A ). Без иммунопреципитации уровни Ago2 в плазме были ниже предела обнаружения с помощью иммуноблоттинга. Отсутствие Ago2 в иммунопреципитатах IgG отрицательного контроля продемонстрировало, что Ago2 специфически осаждается из плазмы.

  Рис. 5.

  В плазме человека существуют бесклеточные циркулирующие рибонуклеопротеиновые комплексы Ago2 – miRNA.( A ) Иммунопреципитация Ago2 из свежей плазмы с низким содержанием тромбоцитов от трех здоровых доноров была обнаружена с помощью иммуноблоттинга. Иммунопреципитация с нормальным мышиным IgG служила отрицательным контролем. Лизат клеток 293T был положительным контролем для Ago2. ( B ) Иммунопреципитаты в A анализировали на указанные miRNA. Столбцы представляют собой долю miRNA, которая была выделена в иммунопреципитат из объема плазмы, используемой для иммунопреципитации. Столбцы с надписью «Все доноры» представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение для трех доноров.

  Чтобы определить, связаны ли циркулирующие miRNA с Ago2, иммунопреципитаты Ago2 и контрольного IgG анализировали на miR-16, miR-92a и let-7a. По сравнению с количеством этих miRNA в общей плазме, от 17% до 26% miR-16 и от 11% до 22% miR-92a присутствовали в иммунопреципитатах Ago2, в зависимости от донора (рис. 5 B ). , Верхний ). Это восстановление может недооценивать Ago2-ассоциированную miRNA, потому что эффективность иммунопреципитации Ago2, вероятно, меньше 100%.Хотя нам не удалось определить эффективность иммунопреципитации Ago2 из плазмы в результате технических ограничений прямого иммуноблоттинга Ago2 входящей плазмы, мы наблюдали, что эффективность из клеточных лизатов с использованием того же антитела составляет не более 60% (рис. S6. ). В среднем уровни miR-16 и miR-92a, обнаруженные в иммунопреципитатах Ago2, были в 55 и 30 раз соответственно выше, чем в иммунопреципитатах IgG отрицательного контроля, что указывает на то, что эти miRNA были специфически связаны с Ago2-содержащими комплексами.Напротив, как Ago2, так и контрольные антитела IgG преципитировали сходные минимальные уровни let-7a у каждого донора, что согласуется с нашей гипотезой о том, что рано элюирующиеся miRNA присутствуют внутри везикул. Мы также проанализировали иммунопреципитаты для трех дополнительных miRNA, идентифицированных с помощью профилирования (фиг. 5 B , Lower ). Все три донора показали значительное обогащение (> 20 раз) miR-122 и miR-150 в иммунопреципитатах Ago2 по сравнению с контрольными IgG. Донор h2-7, у которого отсутствовала miR-142–3p с поздним элюированием (рис.4 B ), также обнаружено небольшое или полное отсутствие специфического соосаждения miR-142–3p с Ago2 (Fig. 5 B ). Однако доноры h2-5 и h2-6 имели ранний и поздний miR-142–3p (рис. S5) и впоследствии показали специфическое соосаждение miR-142–3p с Ago2 по сравнению с контролем IgG (рис. 5 B ). . В целом, каждая изученная нами миРНК с поздним элюированием обнаруживает специфическую ассоциацию с плазменными комплексами Ago2, но миРНК, ограниченные ранними фракциями, не доступны для иммунопреципитации Ago2.

  Для дальнейшей проверки нашей гипотезы о том, что циркулирующие миРНК с поздним элюированием связаны с Ago2, мы определили профиль элюирования Ago2 на нашей колонке. С теми же фракциями плазмы, описанными ранее, мы провели иммунопреципитацию / иммуноблоттинг Ago2. Фракции не замораживали перед иммунопреципитацией и не использовали детергент, чтобы избежать потенциального лизиса везикул, присутствующих в ранних фракциях. Мы обнаружили Ago2 во фракционированной плазме всех трех доноров (рис. 6 A , Lower ).Ago2 широко распределялся в виде единственного пика во фракциях с 13 по 21 и не обнаруживался в ранних фракциях. Это распределение согласуется с комплексом Ago2, не связанным с пузырьками, в кровообращении. Мы сравнили профиль элюции Ago2 со средней относительной численностью miR-16, miR-92a и let-7a, ранее определенной для каждой фракции, и обнаружили, что Ago2 кофракционирует с miR-16 и miR-92a, но не с let-7a (рис. 6 А ). Т.о., Ago2 кофракционируется с miRNAs с поздним элюированием, как ожидалось для рибонуклеопротеинового комплекса, а не с miRNA с ранним элюированием, которые могут быть связаны с везикулами.

  Рис. 6.

  Поздно элюируемые miRNAs специфически присутствуют в циркулирующих рибонуклеопротеиновых комплексах Ago2. ( A ) Относительные копии miR-16, miR-92a и let-7a в каждой фракции плазмы, показанной на фиг. 2, усредняли A — C ( верхний ). Точки представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение для трех доноров. Иммунопреципитация Ago2 из тех же фракций плазмы указанных доноров была обнаружена с помощью иммуноблоттинга ( Lower ). Лизат клеток 293T (дорожка, обозначенная «+») был положительным контролем для иммуноблоттинга.Номера дробей относятся к обеим панелям. ( B ) Иммунопреципитаты фракции плазмы Ago2 в A анализировали на указанные miRNA. Оси и соответствуют доле каждой миРНК, восстановленной в иммунопреципитате Ago2 данной фракции, по отношению к общему количеству этой миРНК, обнаруженной во всех фракциях плазмы для соответствующего донора. Точки представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение от трех доноров. ( C ) Для каждого донора рассчитывали кумулятивную миРНК, обнаруженную в иммунопреципитатах Ago2 всех фракций плазмы, относительно общей миРНК, обнаруженной во всех фракциях плазмы.Столбики представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение для трех доноров.

  Чтобы подтвердить, что Ago2, наблюдаемый во фракциях плазмы, был связан с кофракционирующей miRNA, мы проанализировали иммунопреципитаты Ago2 каждой фракции плазмы на miRNA. Мы последовательно обнаруживали miR-16, miR-92a и miR-122, которые все были сильно обогащены в поздних фракциях, в этих иммунопреципитатах Ago2 из фракционированной плазмы человека от всех доноров (фиг. 6 B ). miR-150 и miR-142–3p также были обнаружены, но на более низких уровнях, что согласуется с их присутствием в ранних и поздних фракциях.Напротив, очень низкие уровни ранней элюируемой miRNA let-7a присутствовали в иммунопреципитатах Ago2. Примечательно, что иммунопреципитация Ago2 из фракций плазмы, по-видимому, более эффективно восстанавливает миРНК по сравнению с иммунопреципитацией из нефракционированной плазмы, описанной ранее. Комбинирование Ago2-ассоциированной miRNA, присутствующей во фракциях, показало, что в среднем 27% miR-92a, 25% miR-16 и miR-122 и 16% miR-150 и miR-142–3p были связаны с Ago2. (Рис.6 C ).Взятые вместе, наши результаты показывают, что эти циркулирующие miRNAs присутствуют в невезикулярных Ago2 рибонуклеопротеиновых комплексах и поддерживают эти комплексы как механизм стабильности циркулирующей miRNA.

  Discussion

  Недавние исследования показали, что внеклеточные miRNAs связаны с микровезикулами и экзосомами, что привело к современной модели, согласно которой miRNAs в кровотоке защищены от РНКаз посредством инкапсуляции в пузырьки. Используя систематический подход к характеристике циркулирующих миРНК, мы обнаружили, что существует по крайней мере две популяции циркулирующих миРНК.Хотя мы подтвердили, что некоторые miRNA в плазме связаны с пузырьками, они составляют меньшинство, тогда как потенциально 90% miRNAs в кровотоке присутствуют в не связанной с мембраной форме, что соответствует рибонуклеопротеиновому комплексу. Эти не связанные с везикулами miRNAs были специфически дестабилизированы перевариванием протеиназой K плазмы, дополнительно поддерживая защиту белковым комплексом как механизм их стабильности в циркуляции, богатой РНКазами. Мы установили существование такого комплекса с помощью иммунопреципитации и идентифицировали циркулирующий комплекс Ago2-miRNA, отличный от везикул.Для микроРНК, которые мы изучили подробно, каждая миРНК, присутствующая во фракциях поздней хроматографии, также была обнаружена в иммунопреципитированных циркулирующих рибонуклеопротеиновых комплексах Ago2. Таким образом, наше исследование выявляет внеклеточную локализацию комплексов Ago2-miRNA в кровообращении человека и обеспечивает модель стабильности невезикулярных циркулирующих miRNAs.

  Примечательно, что мы наблюдали miRNA, которые связаны исключительно с пузырьками, а также miRNA, которые были выделены исключительно во фракциях рибонуклеопротеинового комплекса.Хотя возможны несколько интерпретаций, мы предполагаем, что miRNA, ассоциированные с пузырьками, по сравнению с ассоциированными с Ago2 комплексами, происходят из разных типов клеток и отражают механизмы экспрессии и / или высвобождения miRNA, специфичные для клеточного типа. Например, специфическая для печени miRNA miR-122 (27) была обнаружена только во фракциях, связанных с белками, что позволяет предположить, что гепатоциты могут высвобождать miR-122 через путь носителя белка. Напротив, miRNA, которые были преимущественно ассоциированы с везикулами, такие как let-7a, могут происходить из типов клеток, которые, как известно, генерируют везикулы, включая ретикулоциты, выделяющие экзосомы во время созревания до эритроцитов (28) или тромбоциты, выделяющие микровезикулы при активации (12, 13).

  Идентификация отдельных циркулирующих популяций miRNA может влиять на развитие специфических miRNA как биомаркеров. Для биомаркерных miRNAs, которые, как было обнаружено, разделяются на специфические комплексы, стратегии очистки могут служить для обогащения этих miRNA и повышения чувствительности биомаркеров. Уже предложены стратегии анализа биомаркеров miRNA, основанные на очистке экзосом (6, 7, 18). Наши результаты предполагают, что такие стратегии могут быть неэффективными для биомаркеров miRNA, которые циркулируют как неэксосомные комплексы Ago2, и что иммуноаффинное обогащение комплексов Ago2 может быть эффективной стратегией для повышения чувствительности и производительности биомаркеров miRNA во многих случаях.

  Хотя miRNA постоянно обнаруживались в комплексах Ago2, мы обнаружили, что часть каждой проанализированной miRNA осталась в супернатанте после иммунопреципитации Ago2. Учитывая, что эффективность иммунопреципитации из клеточных лизатов составляла самое большее 60% и могла быть даже ниже из плазмы, можно предположить, что Ago2 как носитель miRNA может составлять все циркулирующие miRNA, не инкапсулированные в везикулы. Однако другие комплексы miRNA также могут существовать в плазме и их еще предстоит обнаружить.Доступные в настоящее время реагенты не позволяют провести окончательный анализ трех других белков Ago, кодируемых геномом человека, и эти дополнительные белки Ago могут также служить переносчиками циркулирующей miRNA. Кроме того, культивируемые фибробласты секретируют нуклеофозмин 1, который способен защищать миРНК от деградации in vitro (29). Еще неизвестно, присутствует ли нуклеофозмин 1 в бесклеточной циркуляции и связывается ли с miRNAs in vivo.

  Наши результаты убедительно подтверждают гипотезу, что циркулирующие комплексы Ago2 служат значительным переносчиком miRNAs в плазме.Помимо полезности циркулирующих миРНК в качестве биомаркеров заболевания, потенциальная функция внеклеточных миРНК была областью активных исследований. Внеклеточные миРНК были предложены в качестве средства межклеточной коммуникации (6, 14, 16), а опосредованный экзосомами перенос миРНК между клетками был зарегистрирован в культуре клеток (15) и от микровезикул, полученных из плазмы, к эндотелиальным клеткам в экспериментальных условиях. (17). Существует также прецедент механизма связи РНК на основе белка-носителя у растений, при котором PSRP1 секретируется во флоэму и опосредует системный перенос малых РНК от клетки к клетке (30).Наше открытие комплексов Ago2-miRNA в циркуляции поднимает интересную возможность того, что в качестве основного каталитического компонента miRNA-индуцированного комплекса сайленсинга (22) эти комплексы могут быть готовы регулировать экспрессию генов в реципиентных клетках.

  Материалы и методы

  Образцы плазмы и сыворотки.

  Образцы плазмы и сыворотки человека от здоровых доноров были получены после получения письменного информированного согласия в соответствии с руководящими принципами Хельсинкской декларации и с этического одобрения местных наблюдательных комиссий.

  Подготовка и визуализация везикул.

  Везикулы получали ультрацентрифугированием свежей бедной тромбоцитами плазмы при 120 000 × g в течение 70 мин при 4 ° C. Везикулы фиксировали, контрастировали оксалатом уранила и визуализировали с помощью трансмиссионной ЭМ.

  Эксклюзионная хроматография.

  В колонку с сефакрилом S-500 (GE Healthcare) вводили 0,5 мл бедной тромбоцитами плазмы или сыворотки и элюировали раствором PBS (pH 7,4) при комнатной температуре. Перед использованием фракции хранили при 4 ° C.

  Выделение РНК, qRT-PCR и профилирование miRNA.

  РНК

  выделяли с помощью набора miRNeasy (Qiagen). Изменения в протоколе производителя представлены в документе SI «Материалы и методы» . Индивидуальные миРНК были обнаружены с помощью анализа TaqMan qRT-PCR, как описано (25). Образцы были профилированы для 375 miRNA с использованием miRNA Ready-to-Use PCR, Human Panel I, V2.M qRT-PCR array (Exiqon).

  Иммунопреципитация и иммуноблоттинг.