Воссоединение травматической диссоциации (техника трехместной диссоциации)
Метод пришел из НЛП (как, впрочем, и большинство методов работы с травмой) и, несмотря на пугающее название;-), очень хорош. В частности, у него есть два существенных плюса:1. Способ работает как с детской, так и со взрослой травмой, то есть время значения не имеет.
2. Попробовав 1 раз с помощью терапевта, клиент может помогать себе самостоятельно. А а много ли методов, которые можно использовать в качестве самопомощи? 🙂
Он реально действенный (прежде чем пробовать на других, попробовала на себе:-), так что говорю со знанием дела).
Метод направлен на формирование самозаботы и самоуспокоения.
1. Вспомните, знакомо ли вам состояние комфорта? Что с вами тогда происходит? Какой (какая) вы тогда? Когда в последний раз было такое состояние? Мысленно войдите в это состояние и, когда будете готовы, дайте знать. (Здесь устанавливается сильный якорь для устойчивого состояния комфорта).
Продолжайте оставаться в этом состоянии, чтобы насладиться им. Там много ресурсов. Это состояние очень нужное и полезное.
2. Удерживая якорь, предложите клиенту визуализировать свое прошлое Я перед собой в самом начале травматического инцидента как в мгновенном снимке. Таким образом, клиент сидит рядом с вами, видя себя более молодого перед собой.
Инструкция: «Нам понадобится это ваше состояние, и я попрошу делать следующее. Вспомните (ИМЯ клиента) в том возрасте, до травмы, до того, как событие произошло. (Якорь снимается, когда начинаются воспоминания). Во что (ИМЯ) одет(а)? Как выглядит? Чем занимался(-лась)?
Вот он(она) такой(-ая) (ИМЯ) пусть там занимается своими делами. Давай его(ее) на время оставим. (Возвращение в ресурсное состояние, якорь 1) Вернитесь в хорошее место, вспомните, как хорошо вам было. Важно, чтобы это состояние всегда сохранялось, вы имеете на него право.
3. Когда клиент может увидеть себя более молодым вполне ясно, попросите его выйти из своего тела так, чтобы он мог увидеть себя, сидящего рядом с вами, и следящего за собой, более молодым (якорь 1).
Теперь он представлен трижды; визуальная перспектива осуществляется с третьего места, действительное тело – на втором, более молодое состояние, проходящее травму, — впереди. Когда эта трехместная диссоциация осуществлена, на нее ставится якорь (№ 2). Удерживаются оба якоря.
Инструкция: Сейчас вы мысленно выплывете аккуратно из своего тела и станете где-нибудь в стороне. Когда представите – дайте знать (Якорь 2).
4. Теперь попросите клиента пройти это переживание, следя за тем, чтобы он сохранил кинестетическую диссоциацию от травматического переживания, используя якоря и речевые паттерны, разделяющие 3 места: он, там, более молодой, то переживание, что случилось тогда; вы, здесь, сегодня, наблюдая за собой, и пр. (Просмотр травмы из третьей позиции – якорь 2, при необходимости – якорь 1).
Инструкция: Я буду вам все время напоминать, что вы смотрите со стороны: видите себя, сидящего здесь, сохраняете эти ресурсы и то, что происходило. Смотрите до самого конца. Когда это пройдет – скажете.
5. Когда переживание полностью просмотрено, предложите клиенту вернуться из третьего места на второе (якорь 1): так визуальная перспектива объединяется с действительным положением тела клиента.
Инструкция: Как вы теперь относитесь к той(тому) молодой(-ому) (ИМЯ)? Говорите ей(ему) хорошие слова, утешайте, пока он(она) не поверит вам, не начнет опираться на тебя, не успокоится. Скажите, что никогда его(ее) не оставите, всегда будете с ним(ней), будете ее(его) защищать.
До тех пор, пока он(а) вам не поверит.
6. Попросите сегодняшнего клиента подойти к себе более молодому (тому, кто прошел через травматическое переживание) и уверить его, что он – из будущего, и дать ему необходимый комфорт, успокоение и чувство, что его ценят (Якорь 1).
7. Когда сегодняшний клиент может увидеть, что визуализируемый, более молодой понимает, дайте им объединиться, пусть эта более молодая часть (визуализация) войдет внутрь тела сегодняшнего клиента (Якорь 1).
Инструкция: Возьмите его(ее) внутрь себя, найди ему(ей) место в своей душе.
Где он(а)? Представьте, что там появилось тепло доброты, сострадания, заботы, и оно разливается по всему телу.
Продолжать до тех пор, пока интеграция полностью не удовлетворит клиента.
8. Экологическая проверка (вспомнить ресурсное состояние).
Примечания
В качестве Якоря № 1 можно использовать талисман («Я его заговорю, и каждый раз, когда ты будешь сжимать его в руках, тебе будет хорошо».)
Если ситуация очень острая или очень свежая, в качестве Якоря № 1 можно попросить, чтобы клиент взял терапевта за руку и предложить, когда будет не хватать ресурсов, держаться за руку терапевта.
Травма происходит, если человека никто не поддержал. Тогда, например, ребенок вынужден справляться за счет собственных весьма ограниченных ресурсов (первичные механизмы защиты), что приводит к формированию травматической структуры личности, и человек привыкает обращаться с собой именно таким образом. Это грустно.
Обязательно спрашиваем клиента о самочувствии, и если оно хорошее – «якорим» то, что есть сейчас.
Если состояние «разобранное», нужен дополнительный ресурс – доступ к ресурсному состоянию в прошлом.
Целенаправленная диссоциация (3-я позиция) максимально уменьшает страдания от переживания травмы.
Воссоединение проводится только в самом конце травмирующего эпизода.
Важный момент – найти картинку в начале, когда клиент не очень знает еще, что с ним будет. Чем дальше воспоминание, тем лучше.
Якорь № 2 удерживается на протяжении всего травмирующего эпизода.
При сильном аффекте – дать ему уйти и снова диссоциировать (если ресурсов не хватает, можно держать на двух якорях).
Конец ситуации травмы – когда человек остался один, тогда его надо жалеть, именно туда даем ресурс.
И не стоит забывать, что иногда убеждение – довольно долгий процесс.
Метод множественной диссоциации. Психотерапевтические этюды.
Метод множественной диссоциации
Чтобы индуцировать состояние глубокого транса, сохранить его и провести сложную работу, автор довольно часто применяет метод индукции множественных зрительных галлюцинаций, при которых испытуемый видит разные, но взаимосвязанные события (в состоянии легкого транса испытуемого можно научить видеть картины в стеклянных или кристаллических шариках).
Одной пациентке, находившейся в глубокой депрессии, совершенно упавшей духом, внушили, что она увидит в стеклянном шарике совершенно забытое событие из счастливых дней ее детства. Она с готовностью согласилась, потому что, вспоминая о счастливом детстве, чувствовала себя еще более несчастной. Учитывая эти мазохистские реакции, женщине внушали, что она видит еще один стеклянный шарик и там, одновременно с первым, — событие, произошедшее в другой период ее жизни. Вскоре в воображении пациентки выстроилась целая дюжина воображаемых стеклянных шариков, и в каждом разыгрывалась сцена из разных лет ее жизни, и в этих сценах участвовали люди, имевшие отношение к ее жизни в прошлом. Так была создана сложная экспериментально-исследовательская и терапевтическая ситуация, а пациентка, благодаря желанию ненадолго испытать состояние легкого транса, на несколько часов была погружена в глубокий гипноз, во время которого мы провели основательный курс гипнотерапии.
Этим методом можно пользоваться не только для индукции галлюцинаторных действий.
Одного музыканта, который не реагировал на прямые гипнотические внушения, попросили вспомнить, как его «мучила однажды навязчивая мелодия». Это привело к тому, что он стал вспоминать и другие подобные случаи. Вскоре он был так поглощен попытками восстановить забытые воспоминания, отбивая такт, что незаметно погрузился в глубокий транс.
Другими словами, явление диссоциации (непроизвольное или внушенное) можно использовать, неоднократно повторяя его, чтобы создать психологическое состояние, при котором испытуемый охотно и легко дает погрузить себя в транс.
Метод внушения постгипнотических действий
В одной статье, написанной автором совместно с Э. М. Эриксон, обращалось внимание на самопроизвольный гипноз, который развивается в связи с выполнением постгипнотических заданий. В ходе гипнотического сеанса врач незаметно и ненавязчиво может сделать постгипнотическое внушение, исполнение которого в свою очередь вызовет самопроизвольное погружение в транс. Этот гипноз может стать исходным состоянием для развития какого-нибудь иного состояния транса.
Иногда испытуемому, который находится в состоянии легкого транса, делается простое постгипнотическое внушение. Когда при выполнении постгипнотического действия он самопроизвольно впадет в транс, можно сделать несколько внушений, чтобы углубить это состояние. Затем эту процедуру повторяют до тех пор, пока не удастся достигнуть состояния глубокого гипноза.
Делая постгипнотическое внушение, автор часто прибегает к такой форме выражений: «Каждый раз, когда я возьму вас за запястье и легонько подниму вашу руку, это будет для вас сигналом что-то выполнить: скажем, двинуть другой рукой, или наклонить голову, или уснуть покрепче; это неважно, но каждый раз, получив такой сигнал, вы будете готовы выполнить задание». Услышав это несколько раз во время первого транса, испытуемый думает, что это относится только к данному сеансу гипноза. Тем не менее, если недели спустя в подходящей обстановке повторить сигнал, это может вызвать быстрое развитие транса.
Что касается самих постгипнотических действий, то лучше давать испытуемому задание исполнить что-нибудь легкое и не требующее сосредоточенного внимания. Например, предложить ему наблюдать за тем, как закуривает врач и попала ли брошенная спичка в урну для мусора, или проверить, лежит ли книга на столе в двух дюймах от края, значительно эффективнее, чем попросить испытуемого хлопнуть в ладоши при слове «карандаш». Чем непринужденней обстановка во время сеанса гипноза, тем легче испытуемому включиться в работу.
При изложении этого материала мы не ставили перед собой цель описать характерные и точные приемы гипноза. Напротив, мы старались показать, что гипноз, прежде всего, должен быть следствием ситуации, в которой межличностные отношения и субъективная оценка строятся так, чтобы они наилучшим образом отвечали целям и врача и пациента.
Этого нельзя достичь, если пользоваться жесткими приемами и строгими методами или стремиться к какой-нибудь одной заданной цели. Из-за сложности человеческого поведения и его скрытых мотивов необходимо считаться с множеством факторов в ситуации, когда два человека вовлечены в одно общее дело. Какова бы ни была здесь роль врача, роль испытуемого неизмеримо больше, ибо его поведение зависит от его способностей, знаний, жизненного опыта, то есть от его личности в целом. Врач может только вести, направлять испытуемого, создавать условия, в которых последний успешно проявил бы себя. Он должен принимать поведение испытуемого и использовать любые его формы для того, чтобы создать новые возможности и ситуации, которые благоприятствовали бы адекватным реакциям испытуемого.
Метод овладения поведением больного
Обычно при наведении транса, как правило, стремятся изменить состояние испытуемого, в каком он находится в начале сеанса, и навязать ему какую-нибудь иную форму поведения. Испытуемому предлагают свободно устроиться в кресле, задержать на чем-нибудь взгляд, постепенно расслабиться и рисовать в воображении приятные картины идеосенсорного характера, что незаметно приводит к состоянию транса.
Применяя метод, основанный на поднятии и опускании руки, Необходимо вызвать у испытуемого ощущение соучастия, интереса к проводимому эксперименту и его собственным идеомоторным реакциям.
Разумеется, такие методы должны предусматривать готовность испытуемого принять и осуществить ту форму поведения, которую ему предлагают или навязывают со стороны. Если испытуемый отвергает навязываемое ему поведение или сопротивляется ему, надо попробовать другой метод, более подходящий и приятный для него, или вызвать у испытуемого утомление настойчивыми действиями гипнотерапевта и добиться от него, пусть неохотного, согласия сотрудничать. Иногда для этого приходится отложить сеанс гипноза. Так или иначе, тем или иным приемом, а противодействие пациента, как правило, преодолевается. Но если метод меняют на другой, слишком долго индуцируют транс или несколько раз переносят попытку ввести его в гипноз на другой сеанс, то эти действия могут оказать нежелательный эффект на пациента и вызвать у него сомнения относительно того, является ли вообще гипноз подходящим для него методом лечения.
Некоторые пациенты нечувствительны к обычным методам индукции транса, но в действительности гипнозу поддаются. Чаще всего они встречаются в психотерапевтической практике но нередки и в обычной медицинской и стоматологической практике Полагают, что лечению гипнозом такие люди не поддаются. Это те пациенты, которые ни за что не согласятся слушаться других, если не считаются сначала с их собственным поведением, их возмущением и сопротивлением. Их физическое состояние, беспокойство, повышенный интерес, озабоченность или поглощенность собственным здоровьем не позволяет им активно или пассивно сотрудничать с врачом; и врач, естественно, испытывает трудности при попытках изменить их поведение. Имея дело с такими пациентами, следует прибегать к методу, который можно назвать «методом овладения поведением». Он также ускоряет и облегчает индукцию транса и у обычного среднего пациента. По сути, это ни что иное, как перевернутый задом наперед обычный метод индукции транса. Обычно при начале индукции транса пациент в той или иной форме должен принять волю врача и сотрудничать с ним.
Ниже приводится несколько клинических случаев, иллюстрирующих различные приемы метода овладения поведением.
МЕТОД.
МЕТОД. Что такое «депривация сна»? Собственно, отказ от сна как такового. Но, надо запомнить, не полный отказ, а частичный.Как было сказано выше, метод работает только с людьми, привыкшими спать более 4 часов в сутки. Сама суть метода состоит в «сбивании» биологических часов
2. Сны, фантазии и жизнь: история случая первичной диссоциации
2. Сны, фантазии и жизнь: история случая первичной диссоциации
В этой главе я вновь попытаюсь показать, какие тонкие качественные различия существуют между различными видами фантазирования.
Я рассматриваю именно фантазирование и вновь привлекаю материал
Создание множественной перспективы
Создание множественной перспективы Одна из эффективных форм совместного обучения обусловлена тем обстоятельством, что люди имеют отличные друг от друга карты мира. Способ, которым один из участников представляет определенную идею или концепцию, может автоматически
8. Метод анкетирования. Метод тестирования. Методы оценки эффективности труда работника
8. Метод анкетирования. Метод тестирования. Методы оценки эффективности труда работника Метод анкетирования является наиболее дешевым способом, который может охватить большую группу людей и большую территорию. Основным плюсом является запас времени, предоставляемый
Метод
Метод
Данный метод, названный «разрушением решения», был не так давно разработан Ричардом Бэндлером, одним из авторов НЛП.
Метод опирается на утверждение, которого многие из нас придерживаются: наше прошлое влияет на наше настоящее и будущее. Если прошлый травмирующий
Метод
Метод Метод, которым я воспользовался в работе с Кейт называется «свистящей» моделью, так как в момент, когда человек взаимозаменяет два образа, бывает полезно издать звук, напоминающий свист. Данная модель была разработана Ричардом Бендлером. Многие годы люди говорили о
Отношение к временным линиям и ассоциации/диссоциации
Отношение к временным линиям и ассоциации/диссоциации Том: Достигнув порога, я прорвался через стеклянную перегородку и ассоциировался с новой деятельностью. Фактически это было чувство контроля и практического выбора — скорее знание, что делать, чем какая-то
Техника диссоциации
Техника диссоциации
Диссоциация своей личности и своей роли (функции, должности, профессии и т.
п.) — универсальный способ создания недоступности, в смысле незадействованности.1. Осознайте свою роль. Четко сформулируйте «сценарий» своей роли и основные элементы,
Метод Куэ
Метод Куэ Разработан метод французским аптекарем Эмилем Куэ. Каждый день, общаясь с покупателями лекарств, Куэ сделал важный вывод: лечебный эффект медикаментов зачастую обусловлен не столько его фармакологическим действием, сколько верой больного в исцеление. Куэ
Метод
Метод В разделе «Метод» рассказывается о том, что было проделано в исследовании. Эта часть обычно делится на несколько подразделов, по крайней мере на подразделы «Испытуемые» и «Процедура». В зависимости от характера исследования можно также включить отдельные разделы
Метод
Метод В процессе клинической работы Шульц постепенно разработал ряд употребимых вербальных формул, которые в соответствии с тем, на что они больше ориентированы — на тело или на разум, — сформировали две базовые серии мысленных упражнений: стандартные и
МЕТОД
МЕТОД
Установив цель или последовательность целей, терапевт должен избрать метод, наиболее подходящий для достижения этих целей.
Начинающий обычно заимствует методы, с которыми познакомился во время обучения индивидуальной терапии, такие, как психоаналитический
Диссоциация тканей – переход к стандартизированным протоколам и повышенной согласованности
14 октября 2015 г.
ВведениеКультура первичных клеток необходима для многих исследовательских и терапевтических применений. Чтобы получить доступ к суспензиям отдельных клеток для дальнейших исследований и культивирования клеток, первым делом нужно начать с образца ткани. Затем ткань необходимо обработать, чтобы отделить клетки, чтобы их можно было изучать дальше. Эти первичные клетки часто используются для биомедицинских исследований, исследований клеточной биологии или для трансплантации и клеточной терапии. Эти отдельные клетки могут быть либо выделены в первичную клеточную культуру, либо собраны вместе и пересеяны для вторичной культуры.
Существует три основных метода диссоциации тканей, и часто эти методы комбинируются.
К ним относятся: ферментативная диссоциация, химическая диссоциация и механическая диссоциация. Ферментативная диссоциация — это процесс использования ферментов для переваривания нарезанных кусочков ткани, что приводит к высвобождению клеток из ткани. В этом процессе используется множество различных типов ферментов, а также их можно использовать в комбинации. Определенные ферменты более эффективны для определенных тканей, поэтому лучше всего подобрать правильный фермент или комбинацию ферментов для каждого конкретного типа ткани.
Химическая диссоциация использует тот факт, что катионы участвуют в поддержании внутриклеточных связей и внутриклеточного матрикса. При введении ЭДТА или ЭГТА, которые связывают эти катионы, межклеточные связи нарушаются.
Наконец, механическая диссоциация требует разрезания, выскабливания или царапания ткани на мелкие кусочки, затем измельченную ткань промывают в среде, чтобы отделить клетки от ткани, а иногда также используют легкое встряхивание, чтобы помочь разрыхлить клетки.
Выбор метода диссоциации обычно делается на основе типа ткани, тканевого происхождения и того, какие методы были признаны наиболее успешными в литературе.
Проблемы диссоциации тканей
Целью большинства процессов диссоциации тканей является получение максимально возможных жизнеспособных клеток и гарантия того, что метод не окажет негативного влияния на жизнеспособность или функцию клеток. Исследователи должны выбрать правильную комбинацию методов диссоциации, чтобы добиться успеха. Большинство полагаются на поиск литературы, но часто сталкиваются с противоречивыми советами. Причины противоречивых данных часто могут быть связаны с различными протоколами и несовместимыми и/или нечистыми ферментами. Несоответствия могут повлиять на способность исследователей точно интерпретировать данные в рамках их собственных экспериментов и сделать повторение эксперимента невозможным для других. Эта изменчивость в процессе выделения также может негативно повлиять на использование этих клеток в приложениях трансплантации или клеточной терапии.
Одним из способов решения проблемы изменчивости является создание стандартизированного протокола диссоциации тканей. Если вы посмотрите на ферментативную диссоциацию в качестве примера, могут возникнуть проблемы с определением правильной концентрации фермента, правильного времени инкубации и правильной температуры; неправильное понимание этих факторов может привести к повреждению клеток или неполной диссоциации.
Кроме того, еще одним важным ключом к решению проблемы изменчивости является анализ качества ферментов. Ферменты бывают разного качества, включая чистоту, качество (т. е. произведенные с использованием надлежащей производственной практики GMP), ферментативную силу и источник (т. е. не животного происхождения). Изменчивость этих продуктов как по классам, так и по партиям является проблемой для исследователей. Изменчивость часто приводит к противоречивым или невоспроизводимым результатам.
Руководство по производству продуктов для клеточной терапии все еще находится в стадии разработки, но в настоящее время одним из применимых стандартов является USP 1046, в котором указывается на важность отбора сырья, используемого в производстве.
Таким образом, при планировании производственного процесса, который в конечном итоге будет представлен на утверждение в государственные органы, важно учитывать такие вопросы, как происхождение сырья, консистенция, риск загрязнения и было ли сырье произведено в соответствии с GMP. В результате растет интерес к ферментам без животного происхождения (AOF) и требованиям надлежащей производственной практики (GMP).
Потребность в протоколах диссоциации тканей размером со статью для клинического применения
Чтобы решить проблемы изменчивости, многие исследователи движутся к созданию стандартизированного протокола с использованием исходных материалов GMP и/или AOF для диссоциации тканей, чтобы обеспечить согласованные воспроизводимые результаты исследований и предоставить соответствующие процедуры для трансплантации и клинических применений клеточной терапии. . Материалы AOF предпочтительнее, потому что они не несут риска возможного заражения случайными агентами, такими как вирусы животного происхождения или прионы.
Для приложений клеточной терапии эти протоколы включают процесс GMP и ферменты класса GMP, поскольку клеточная терапия, которая считается «более чем минимально манипулируемой», будет регулироваться FDA как биологический продукт и, следовательно, должна будет соответствовать стандартам GMP. .
В двух недавних публикациях освещались усилия по созданию согласованных протоколов для применения в области трансплантации и клеточной терапии. Я предоставил краткий обзор документов здесь.
Выделение островков из поджелудочной железы
Необходимость в стандартном протоколе GMP была подчеркнута в недавней статье, опубликованной в журнале Transplantation Direct под названием «Выбор фермента для переваривания поджелудочной железы человека является критическим фактором для увеличения успеха изоляции островков». В статье авторы обсуждают свою работу по выделению островков и важность поиска эффективного и последовательного метода выделения островков из поджелудочной железы. С этой целью они сравнили ключевые параметры островков для оценки общего качества островков после выделения, сравнив три фермента: либеразу HI (Roche Diagnostics), коллагеназу NB1 NP (SERVA Electrophoresis GmbH) и либеразу млекопитающих без тканей (MTF) C/T (Roche Diagnostics).
. Для пояснения: эти ферменты предназначены только для дальнейшей обработки, а не для непосредственного применения у людей.
Трансплантация островковых клеток — еще один вариант лечения диабета 1 типа. При трансплантации островков островки берут из поджелудочной железы донора органов, а затем клетки вводят в печень. По данным Национального центра информации о диабете, «пациенты после трансплантации обычно получают две инфузии, в среднем от 400 000 до 500 000 островков на инфузию. После имплантации бета-клетки в этих островках начинают вырабатывать и выделять инсулин».
Авторы исследования объяснили, что первоначально либераза HI использовалась для выделения островков, и ее использование привело к увеличению числа пациентов, которым можно было провести трансплантацию островков. Однако его использование было прекращено в 2007 году из-за опасений возможного загрязнения прионами из материалов, полученных из крупного рогатого скота.
Либераза HI не была высокоочищенной и имела серьезные проблемы с изменчивостью от партии к партии, поэтому были проблемы с постоянной изоляцией островков и долговременным хранением. Коллегеназу NB1, дополненную нейральной протеазой (NP), использовали в качестве альтернативы либеразе HI, и это позволило продолжить трансплантацию для получения островков клинического уровня.
Авторы исследования использовали перфузионный аппарат и вводили один из трех ферментов в исследовании: либеразу HI, коллагеназу NB1 с NP или либеразу MTF C/T. Затем поджелудочную железу разрезали на части и помещали в пищеварительную камеру Рикорди. Пищеварение считали завершенным, когда 50% или более островков были свободны от ткани.
Они обнаружили, что эффективность пищеварения была значительно выше, индекс стимуляции глюкозы был выше, а островки имели самый высокий показатель успешной трансплантации у мышей с диабетом при использовании либеразы MTF C/T.
Кроме того, изменчивость от партии к партии была намного меньше по сравнению с двумя другими ферментами.
Выделение мезенхимальных стволовых клеток из ткани пуповины
В другом недавнем документе освещалась работа по разработке стандартизированного протокола GMP для диссоциации и хранения мезенхимальных стволовых клеток из ткани пуповины. В статье «Новый протокол клинического уровня для хранения клеток ткани пуповины человека», опубликованный в журнале Transfusion, описывается, как авторы создали надежный и эффективный протокол клинического уровня для выделения мезенхимальных стволовых клеток из ткани пуповины. с использованием комбинации ферментов и полуавтоматического диссоциатора.
Источник клеток для клеточной терапии Мезенхимальные стволовые клетки изучались в клинических испытаниях более 10 лет. За это время были проверены их терапевтические свойства против многих болезней и травм. Некоторые из этих методов лечения включают повреждение тканей, заболевание сетчатки, БАС (боковой амиотрофический склероз, рассеянный склероз) и печеночную недостаточность.
Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) желательны для клеточной терапии, поскольку они обладают способностью к самообновлению и многолинейной дифференцировке в мезодермальные эктодермические и эндодермальные клетки. Хотя МСК можно найти в большинстве тканей, они первоначально были получены из костного мозга. Сейчас их выделяют из многих видов тканей, включая жировую, мышечную, пульпу зуба, плаценту и пуповину. МСК также относительно легко размножаются в культуре. В документе подчеркиваются некоторые положительные свойства МСК, выделенных из UCT, в том числе то, что ткань легко получить, а клетки демонстрируют более высокую скорость пролиферации. В документе также говорится: «UCT-MSC обладают многими преимуществами по сравнению с MSC, выделенными из других тканей взрослого человека, благодаря неинвазивной процедуре сбора, их более высокой способности к пролиферации, их низкой иммуногенности, способности к многолинейной дифференцировке, а также их иммуномодулирующим и трофическим свойствам».
Из-за привлекательных свойств использования МСК в клеточной терапии необходимо изолировать эти клетки таким образом, чтобы это соответствовало требованиям терапевтического применения. Авторы статьи намеревались создать протокол выделения клинического уровня для выделения МСК из UCT. Желание состояло в том, чтобы создать этот протокол с использованием материала GMP, но также с учетом того, что протокол по-прежнему должен поддерживать методы изоляции и криоконсервации, которые создают наилучшие возможности для хорошего выхода и качества изолированных клеток.
Исследование В ходе исследования авторы протестировали две стратегии. Первым была ручная диссоциация, а вторым — полуавтоматическая диссоциация с использованием диссоциатора GentleMACS компании Miltenyi Bio. Для начала всю ткань разрезали на мелкие кусочки и поместили в раствор, содержащий PBS, коллагеназу NB6 класса GMP и гиалуронидазу (медицинский продукт). В ручном методе диссоциации ткань и раствор инкубировали в течение 2,5 часов без перемешивания.
При полуавтоматической диссоциации образец сначала подвергали механической диссоциации с помощью GentleMACS, а затем инкубировали в течение 1,5 часов в растворе.
Сравнивая два метода, авторы обнаружили, что при использовании комбинации полуавтоматической диссоциации с ферментами выделение заняло менее половины времени по сравнению с использованием только ручной диссоциации, что является важной экономией времени и труда при банках большого количества клеток. В процессе также были получены клетки, которые имели те же характеристики, что и клетки, выделенные путем ручной диссоциации.
Резюме
Эти две статьи демонстрируют как необходимость, так и успешное внедрение стандартизированного клинического протокола для выделения клеток из образцов тканей. Текущие производственные инструкции по клеточной терапии указывают на то, что снижение изменчивости, необходимость надлежащей производственной практики и использование материалов неживотного происхождения в отношении диссоциации тканей будут продолжать приобретать все большее значение по мере того, как методы лечения приближаются к коммерциализации.
Таким образом, важно делиться этими протоколами посредством публикации, чтобы другие могли извлечь пользу из опыта и чтобы со временем протоколы продолжали становиться более стандартизированными.
Механическая дезагрегация и ферментативная дезагрегация
Март 2021 г. Поделиться
Методы диссоциации клетокИсследования проводятся поэтапно, и срезание углов дает неточные результаты. Важно следовать правильному протоколу от начала до конца, чтобы обеспечить максимально возможное качество результатов. При работе с клетками любого типа (иммунными клетками, опухолевыми клетками и т. д.) первым шагом всегда является сбор нужного образца клеток из ткани хозяина. Диссоциация , иногда называемая дезагрегацией , включает разрушение клеточной культуры для получения небольшой группы.
Проточная цитометрия Протокол выделения из ткани требует переноса клеток в среду для суспензии отдельных клеток, чтобы проточный цитометр функционировал должным образом.
После того, как клетки отделяются от ткани хозяина, они дополнительно изолируются от остаточных веществ и проходят через проточный цитометр, который использует флуоресцентные лампы для анализа их характеристик. Затем их либо сортируют по группам для дальнейшего тестирования, либо уничтожают, если исследователи получают искомую информацию.
Диссоциация — необходимый метод, который позволяет исследователям нацеливаться и изолировать типы клеток, которые они пытаются изучать. Однако в зависимости от характеристик клеток различные варианты диссоциации могут быть более или менее полезными для эксперимента. В настоящее время существует три метода диссоциации клеток: механический, ферментативный и химический.
Механическая диссоциация Механическая диссоциация — простейшая из трех, разрушающая ткань с помощью физической силы, такой как разрезание, раздавливание или соскабливание. В этом методе обычно используется инструмент в виде ступки и пестика, чтобы разбить и уничтожить извлеченный образец, оставив после себя фрагментированные кусочки.
Среди этих фрагментов искомые клетки должны свободно плавать для дальнейшего разделения.
Механическая диссоциация клеток удобна при работе со слабо связанными образцами, поскольку она выполняется быстро. Физическое разделение происходит быстро и не требует периода ожидания.
Однако механическая диссоциация также показала противоречивые результаты у разных пользователей. Выход клеток и жизнеспособность клеток могут сильно различаться при сравнении одного испытания с другим.
Этот процесс предпочтителен при работе с костным мозгом, лимфатическими узлами, селезенкой и другими тканями, которые не слишком плотно связаны.
Ферментативная диссоциация Другим методом диссоциации клеток является ферментативная диссоциация. Ферментативная диссоциация использует специфические белки для дезагрегации образцов клеточных культур. В процессе применяются ферменты, такие как трипсин или коллагеназа, которые расщепляют кусочки ткани для высвобождения клеток-мишеней.
Тип фермента зависит от типа ткани, и поиск правильной комбинации приводит к оптимальным результатам.
При использовании правильного фермента диссоциации клеток этот процесс чрезвычайно эффективен. Проведение обширных исследований — идеальный способ оптимизировать выход клеток.
Частично из-за исследований и самих ферментов этот метод требует больше времени, чем механическая диссоциация. Ферменты также могут непреднамеренно модифицировать белки на поверхности клеток-мишеней, изменяя их функцию или то, как их идентифицирует проточный цитометр.
Ферментативная диссоциация используется для более плотных тканей, которые могут содержать большое количество мусора. Использование ферментов может уменьшить количество волокнистой соединительной ткани, что приводит к более высокому выходу клеток из таких органов, как печень.
Химическая диссоциация Третий метод, используемый для диссоциации клеток, называется химической диссоциацией .
В этом процессе используются катионы, которые скрепляют внутриклеточные связи. Катионы — это положительно заряженные атомы, и добавление химического соединения со сродством к ним вызывает растворение связей внутри ткани. EGTA или egtazic acid являются примером соединения с этим свойством.
Химическая диссоциация не изменяет поверхность клетки, в отличие от ферментативной диссоциации, что делает ее очень безопасной и щадящей альтернативой. Это также обеспечивает высокую жизнеспособность и количество клеток после размножения, поскольку культивируемые клетки обычно здоровы.
Этот процесс может занять много времени и, подобно ферментативной диссоциации, дает противоречивые результаты. Тип используемых химических веществ, количество, концентрация и окружающая среда могут влиять на общую функциональную способность этого процесса.
Этот метод обычно используется для более мягких форм диссоциации, таких как эмбриональные клетки.
Выбор правильного метода При выборе метода, который лучше всего подходит для эксперимента, необходимо учитывать три основных фактора: время, размер популяции и выборка видов.
В сущности, механическая диссоциация клеток является самым быстрым и простым методом разрушения ткани. Если имеется огромная популяция хозяина или образец, дробление клеток не очень рискованно. Однако, если вы работаете с редкими клетками, которые менее распространены, может быть полезно использовать что-то мягкое, например, химическую диссоциацию. Сохранение необычных клеток является главным приоритетом, если получить другой образец будет сложно или дорого. Последнее соображение заключается в том, какой тип ткани подвергается диссоциации. Ферментативная диссоциация является одним из наиболее применимых методов для множества различных клеток и, следовательно, может быть единственным вариантом правильного разрушения.
Конечная цель диссоциации ткани — собрать как можно больше жизнеспособных клеток, не оказывая негативного влияния на жизнеспособность или функцию клеток. Для достижения успеха может потребоваться комбинация методов и большое количество исследований.
Это исследование затруднено из-за несоответствия данных в разных лабораториях и отсутствия общеотраслевого стандартизированного протокола выделения клеток из тканей.
Диссоциация и дезагрегация клеточной ткани являются жизненно важными шагами в начале широкого спектра исследовательских приложений, включая исследования в области разработки методов лечения рака, создания вакцин и размножения клеток. Оптимизированный протокол диссоциации может сэкономить время и деньги, а также предоставить высокообогащенную популяцию здоровых клеток, представляющих интерес для последующей обработки и анализа.
Микропузырьки Akadeum После начальных этапов диссоциации ткани исследователь часто остается со смешанным образцом нежелательного вещества, плавающим среди нужных им клеток. Часто необходимо использовать дополнительную стадию разделения клеток для дальнейшей очистки образца. Хотя существует множество полезных методов для дальнейшего выделения, один из них выделяется своей способностью доставлять высокообогащенный образец при сохранении физиологии клеток — BACS.
